DFMG调节TLR4/VEGF-A抗宫颈癌血管新生的机制研究

发布时间：2023-05-19 19:13

　　目的:宫颈癌患者死亡的主要原因是肿瘤的复发、未控和转移,且约有35%的患者会发生复发/未控。复发/未控的治疗难点在于:受之前治疗手段的影响(手术、放疗或化疗),后续治疗方法常常受到限制,预后很差。血管新生是宫颈癌发生发展中的重要步骤,目前抗血管新生药物联合化疗已成为复发/未控性宫颈癌的首选治疗方案。但现有的抗血管新生药物仍存在很多局限,在降低副反应、降低费用、提高疗效等方面仍有很大的提升空间。临床上迫切需要寻找经济有效、低毒安全的新型抗血管新生药物,从植物提取物中研发抗血管新生药物是一个极富吸引力的方向。7-二氟亚甲基-5,4’-二甲烷氧基异黄酮(7-difluoromethoxy-5,4’-dimethoxygenistein,DFMG)是本课题组前期从植物中提取的新化学实体,已证实能通过调控Toll样受体4(Tolllike receptor 4,TLR4)抑制动脉粥样硬化过程中的血管新生。有研究表明宫颈癌细胞中TLR4呈高表达状态,且与VEGF-A之间存在明显正相关性,研究猜想DFMG是否可通过调控TLR4/VEGF-A路径抑制宫颈癌血管新生。本课题以宫颈癌Siha细胞和静脉内皮...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
引言
第一部分 DFMG对宫颈癌血管新生的影响
    1.1 实验材料
        1.1.1 细胞系
        1.1.2 药品和试剂
        1.1.3 仪器和设备
        1.1.4 试剂的配制
        1.1.5 抗体
    1.2 实验方法
        1.2.1 细胞培养
        1.2.2 CCK-8试剂盒检测细胞活力
        1.2.3 Matrigel基质胶小管形成实验
        1.2.4 细胞划痕实验
        1.2.5 鸡胚绒毛尿囊膜(Chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)血管形成实验
        1.2.6 酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA)
        1.2.7 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)
        1.2.8 统计学分析
    1.3 实验结果
        1.3.1 不同浓度的DFMG对细胞活力的影响
        1.3.2 宫颈癌Siha细胞上清液对Matrigel基质胶小管形成的影响
        1.3.3 宫颈癌Siha细胞上清液对HUVE-12 细胞迁移能力的影响
        1.3.4 宫颈癌Siha细胞上清液对CAM膜血管形成的影响
        1.3.5 DFMG对宫颈癌Siha细胞VEGF-A蛋白分泌的影响
        1.3.6 DFMG对宫颈癌Siha细胞VEGF-A蛋白表达的影响
    1.4 讨论
    1.5 小结
第二部分 TLR4/VEGF-A路径对宫颈癌血管新生的影响
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞系
        2.1.2 药品和试剂
        2.1.3 仪器设备
        2.1.4 试剂的配置
        2.1.5 慢病毒载体与小干扰RNA靶序列
        2.1.6 引物
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞培养
        2.2.2 TLR4 基因过表达慢病毒稳定转染宫颈癌Siha细胞
        2.2.3 TLR4 基因小干扰RNA(Si RNA)瞬时转染宫颈癌Siha细胞
        2.2.4 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)
        2.2.5 实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)
        2.2.6 实验分组
        2.2.7 Matrigel基质胶小管形成实验
        2.2.8 细胞划痕实验
        2.2.9 鸡胚绒毛尿囊膜(Chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)血管形成实验
        2.2.10 统计学方法
    2.3 实验结果
        2.3.1 TLR4 基因过表达慢病毒和小干扰RNA(Si RNA)分别转染宫颈癌Siha细胞的验证
        2.3.2 干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对Matrigel基质胶小管形成的影响
        2.3.3 干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对HUVE-12细胞迁移的影响
        2.3.4 干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对CAM膜血管形成的影响
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三部分 DFMG干预TLRE/VEGF-A对宫颈癌血管新生的影响
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞系
        3.1.2 药品和试剂
        3.1.3 仪器和设备
        3.1.4 试剂的配置
        3.1.5 抗体
        3.1.6 引物
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞培养
        3.2.2 实验分组
        3.2.3 Matrigel基质胶小管形成实验
        3.2.4 细胞划痕实验
        3.2.5 鸡胚绒毛尿囊膜(Chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)血管形成实验
        3.2.6 酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA)
        3.2.7 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)
        3.2.8 实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)
    3.3 实验结果
        3.3.1 DFMG干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对Matrigel基质胶小管形成的影响
        3.3.2 DFMG干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对HUEV-12细胞迁移的影响
        3.3.3 DFMG干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对CAM膜血管形成的影响
        3.3.4 DFMG干预TLR4/VEGF-A对宫颈癌Siha细胞VEGF-A蛋白分泌的影响
        3.3.5 DFMG干预TLR4/VEGF-A对宫颈癌Siha细胞TLR4、VEGF-A蛋白表达的影响
        3.3.6 DFMG干预TLR4/VEGF-A对宫颈癌Siha细胞TLR4、VEGF-A m RNA表达的影响
    3.4 讨论
    3.5 小结
结论
参考文献
综述
    参考文献
附录
攻读硕士学位期间主要成果
致谢



本文编号：3819939