Huwe1在卵巢癌发生发展中的作用

发布时间：2017-05-23 08:29

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【摘要】：Huwe1 (HECT,UBA and WWE domain containingl),是一个含有HECT域的E3泛素连接酶,泛素连接酶是泛素化发生过程中必不可少的三个关键酶之一。泛素化是指在泛素激活酶E1、结合酶E2和泛素连接酶E3等一系列酶共同作用下,泛素分子对蛋白底物进行特异的修饰,在蛋白降解、功能调节过程中发挥重要作用。而Huwe1就是这么一种泛素连接酶。含Hect结构域的泛素连接酶,则被认为是癌症发生发展过程中的重要调节因子。作为含Hect结构域E3泛素连接酶的Huwe1也一直被认为是癌症发生的重要调节因子,但是人们对其在增殖、凋亡、癌症发生发展中所起的作用一直有不同看法：因为Huwe1编码的蛋白巨大(500KD),导致长期以来一直未能完全克隆全长基因,编码蛋白的功能也无法确定。直到2005年两个实验室同时克隆出Huwe1基因的全长,确认其为E3泛素连接酶,并发现了其作用的底物。但是两个实验室发表的文章中对其在增殖、凋亡、癌症发生中所起的作用就有了不同看法。后来陆续的实验发现其作用底物包括Mcl-1、p53、N-MYC、C-MYC、组蛋白、CDC6等,这其中既有抑癌基因又有癌基因。并且在人癌症标本中,研究结果也存在很大争议：胃癌、前列腺癌、乳腺癌等组织中,Huwe1表达升高,提示Huwe1可能促进癌症发生；而在畸胎瘤细胞表达明显偏低,胶质母细胞瘤系中Huwe1发生突变,提示Huwe1可能是抑癌基因。越来越多的研究没有使得Huwe1具体功能得到合理阐述,反而使问题更加扑朔迷离。因此Huwel的具体功能有待进一步研究,阐述这一问题将对相关癌症发病机制等有重要意义。卵巢癌是女性生殖系统癌症恶性化及死亡率很高的疾病,但是关于Huwel在卵巢癌中功能的研究却很少,这使得卵巢癌成为研究Huwe1在癌症发生、发展中作用的理想对象。研究表明约90%的卵巢癌起源于覆盖卵巢的上皮细胞,卵巢癌中最常见的遗传学变异是c-Myc、K-ras基因扩增以及P53突变等。鉴于此我们利用表达K-ras, c-Myc和沉默p53基因的慢病毒注射至Huwe1 (flop)小鼠的卵巢囊中,试图模拟卵巢癌发生的过程。但是Huwe1 (flop)小鼠的卵巢囊存在缺陷型裂口,会导致病毒液泄露。因此我们改变策略,通过分离、病毒感染Huwe1 (flop)小鼠卵巢上皮细胞(Mose细胞),使其恶性转化,建立Huw el敲除的恶性转化细胞株Mose-cre (Huwe1-)和Huwel未敲除的恶性转化细胞株Mose-creER(Huwel+),模拟卵巢癌发生发展的过程。两种细胞株建立后,我们对两种细胞株细胞的低血清耐受能力、细胞迁移能力、细胞侵袭能力以及克隆形成能力等一系列肿瘤相关表型之间的差别进行比较,试图分析在小鼠卵巢上皮细胞发生发展中Huwel发挥的具体作用。在确定Huwel在恶性转化小鼠卵巢上皮细胞发挥具体功能以后,我们对Huw el在恶性转化小鼠卵巢上皮细胞发挥作用的可能机制进行了探讨。通过在恶性转化小鼠卵巢上皮细胞中Huwel发挥的功能与机制模拟卵巢癌发生发展过程中Huwel的作用。
【关键词】：Huwe1 卵巢上皮细胞 恶性转化 卵巢癌发生发展
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 缩略语9-12
• 第一章 绪论(Introduction)12-22
• 1.1 选题背景和意义12-13
• 1.2 文献综述及研究现状13-19
• 1.2.1 肿瘤、癌基因、抑癌基因13
• 1.2.2 卵巢癌相关的原癌基因、抑癌基因13-15
• 1.2.3 基因治疗15-16
• 1.2.4 卵巢癌的基因治疗16-18
• 1.2.5 Huwel与卵巢癌18-19
• 1.3 试验设计、试验内容19-22
• 第二章 材料与方法(Materials and Methods)22-48
• 2.1 实验仪器与材料试剂22-26
• 2.1.1 实验仪器22-23
• 2.1.2 实验材料、试剂23-25
• 2.1.3 本研究中常用试剂的配制25-26
• 2.2 实验方法26-48
• 2.2.1 小鼠卵巢上皮细胞的分离26-27
• 2.2.2 小鼠卵巢上皮细胞的培养27-28
• 2.2.3 小鼠卵巢上皮细胞恶性转化载体构建28-36
• 2.2.4 慢病毒包装和浓缩,慢病毒滴度检测36-37
• 2.2.5 小鼠卵巢上皮细胞的恶性转化37
• 2.2.6 病毒感染情况检测37-40
• 2.2.7 细胞样本总RNA提取40-41
• 2.2.8 Transwell细胞小室迁移试验41
• 2.2.9 Transwell细胞小室侵袭试验41-42
• 2.2.10 细胞划痕实验42
• 2.2.11 流式细胞术42-43
• 2.2.12 实时定量荧光PCR(Realtime PCR)43-45
• 2.2.13 软琼脂克隆形成实验45-46
• 2.2.14 荧光素酶报告试验(Luciferase Reporter Assay)46-48
• 第三章 结果(Results)48-62
• 3.1 小鼠卵巢上皮细胞恶性转化细胞系的建立48-52
• 3.1.1 分离小鼠卵巢上皮细胞49
• 3.1.2 载体构建及病毒包装49-50
• 3.1.3 病毒感染细胞50-51
• 3.1.4 细胞形态观察51-52
• 3.2 Huwe1敲除对恶性转化小鼠卵巢上皮细胞的影响52-57
• 3.2.1 Huwe1敲除对恶性转化小鼠卵巢上皮细胞低血清耐受的影响52-54
• 3.2.2 Huwe1敲除对恶性转化小鼠卵巢上皮细胞迁移侵袭能力影响54-56
• 3.2.3 Huwe1敲除对恶性转化小鼠卵巢上皮细胞克隆形成能力影响56-57
• 3.3 Huwel在恶性转化小鼠卵巢上皮细胞中作用机制的研究57-62
• 3.3.1 转录组测序技术(RNAseq)结果57-59
• 3.3.2 Real-timePCR验证结果符合RNAseq结果59
• 3.3.3 双荧光素酶系统检测Wnt信号通路59-62
• 第四章 讨论(Discussions)62-64
• 参考文献(References)64-68
• 附录68-74
• 致谢74-76
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 杨念念;严亚琼;龚洁;张思维;郑荣寿;陈万青;;中国2003～2007年卵巢癌发病与死亡分析[J];中国肿瘤;2012年06期

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本文编号：387406