GRP78在卵巢癌细胞自噬与细胞凋亡中的作用研究

发布时间：2017-06-03 23:12

  本文关键词：GRP78在卵巢癌细胞自噬与细胞凋亡中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的本研究旨在探讨GRP78在卵巢癌细胞自噬与细胞凋亡中的作用及其作用机制,了解其对卵巢癌细胞生长情况及对顺铂敏感性的影响,从而为卵巢癌的治疗提供新思路,为克服卵巢癌顺铂耐药提供新方法。方法本研究通过体外培养人卵巢癌细胞株SKOV3,以GRP78调节因子BAPTA-AM、A23187分别下调、上调卵巢癌细胞中GRP78表达,以RT-PCR、Western Blot蛋白印迹法分别检测SKOV3细胞中Beclin-1、Bcl-2、CHOP m RNA及其蛋白表达水平改变;以GFP-LC3-II荧光染色法观察细胞自噬水平变化;以Annexin V-FITC法检测肿瘤细胞凋亡变化,以明确GRP78在卵巢癌细胞自噬与细胞凋亡中的作用;以MTT法检测顺铂对卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制率,了解GRP78对卵巢癌细胞生长情况及其对顺铂敏感性的影响。结果1.SKOV3细胞中GRP78对Beclin1、Bcl-2、CHOP m RNA表达的影响经GRP78调节因子BAPTA-AM和A23187分别下调、上调SKOV3细胞中GRP78表达后,卵巢癌细胞SKOV3中Beclin1 m RNA的相对表达量分别为(0.8605±0.05478)、(0.6537±0.06500),与对照组相对表达量(0.7724±0.02871)相比,差异有统计学意义(t=2.768,P0.05;t=2.893,P0.05)。Bcl-2 m RNA的相对表达量分别为(0.7136±0.03230)、(0.9075±0.04730),与对照组相对表达量(0.8450±0.01785)相比,差异有统计学意义(t=3.334,P0.05;t=3.920,P0.05)。CHOP m RNA的相对表达量分别为(0.8108±0.00380)、(0.6195±0.06148),与对照组相对表达量(0.7116±0.07689)相比,差异有统计学意义(t=3.141,P0.05;t=2.877,P0.05)。2.SKOV3细胞中GRP78对Beclin1、Bcl-2、CHOP蛋白表达的影响经GRP78调节因子BAPTA-AM和A23187分别下调、上调SKOV3细胞中GRP78表达后,卵巢癌细胞SKOV3中Beclin1蛋白的相对表达量分别为(0.9521±0.02238)、(0.6375±0.02489),与对照组相对表达量(0.7890±0.08349)相比,差异有统计学意义(t=3.268,P0.05;t=3.012,P0.05)。Bcl-2蛋白的相对表达量分别为(0.3854±0.03231)、(0.5956±0.02902),与对照组相对表达量(0.4918±0.03551)相比,差异有统计学意义(t=3.810,P0.05;t=3.248,P0.05)。CHOP蛋白的相对表达量分别为(0.6813±0.09462)、(0.4313±0.09534),与对照组相对表达量(0.5306±0.00110)相比,差异有统计学意义(t=3.404,P0.05;t=3.222,P0.05)。3.SKOV3细胞中GRP78对细胞自噬的影响经GRP78调节因子BAPTA-AM和A23187分别下调、上调SKOV3细胞中GRP78表达后,卵巢癌细胞SKOV3中自噬体荧光值分别为(706.25±117.258)、(473.17±127.903),与对照组荧光值(594.58±126.232)相比,差异有统计学意义(t=5.381,P0.05;t=4.380,P0.05)。4.流式细胞技术检测GRP78对SKOV3细胞凋亡的影响BAPTA-AM处理后,SKOV3细胞凋亡率为27.42%,对照组为19.57%,实验组与对照组相比凋亡率增加。而A23187处理后,SKOV3细胞凋亡率为12.21%,与对照组相比凋亡率降低。5.BAPTA-AM、A23187对SKOV3细胞顺铂敏感性的影响SKOV3细胞的顺铂IC50为(3.02±0.624)μg/ml。经BAPTA-AM下调SKOV3细胞GRP78表达后,SKOV3细胞的顺铂IC50为(2.00±0.172)μg/ml,其对顺铂的敏感性增加了33.78%,与对照组相比差异有统计学意义(t=17.787,P0.05)。而经A23187上调GRP78后,SKOV3细胞顺铂IC50为(4.91±2.515)μg/ml,对顺铂敏感性降低了62.58%,与对照组相比差异有统计学意义(t=29.516,P0.05)。结论1.GRP78通过调节Beclin1、Bcl-2、CHOP等基因表达而影响卵巢癌SKOV3细胞自噬与细胞凋亡水平,进而影响卵巢癌顺铂敏感性,调节GRP78表达可能成为治疗卵巢癌、提高卵巢癌顺铂敏感性的新方法。2.GRP78可能通过调节肿瘤细胞自噬与细胞凋亡途径在卵巢癌顺铂耐药中发挥重要作用。
【关键词】：卵巢癌 GPR78 自噬 凋亡 顺铂耐药
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 缩略语/符号说明12-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 材料和方法16-32
• 1.1 材料16-20
• 1.1.1 细胞株16
• 1.1.2 主要仪器设备16-17
• 1.1.3 相关试剂及耗材17-18
• 1.1.4 主要液体配制18-20
• 1.2 实验方法20
• 1.2.1 细胞培养20
• 1.2.2 药物配制20
• 1.3 RT-PCR检测SKOV3细胞中Beclin1、Bcl-2、CHOP的mRNA表达20-24
• 1.3.1 实验分组及处理20
• 1.3.2 细胞总RNA提取20-21
• 1.3.3 紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度21
• 1.3.4 RNA逆转录合成cDNA21
• 1.3.5 PCR21-23
• 1.3.6 琼脂糖凝胶电泳23
• 1.3.7 实验结果分析方法23-24
• 1.4 Western Blot法检测SKOV3细胞中Beclin1、Bcl-2、CHOP的蛋白表达24-28
• 1.4.1 实验分组及处理24
• 1.4.2 细胞总蛋白的提取24
• 1.4.3 蛋白质总浓度的测定24-25
• 1.4.4 蛋白质变性25
• 1.4.5 SDS-PAGE电泳、电转移及封闭25-27
• 1.4.6 蛋白质免疫检测27
• 1.4.7 辣根过氧化物酶（HRP）法显影27-28
• 1.4.8 实验结果分析方法28
• 1.5 GFP-LC3-Ⅱ荧光染色法检测细胞自噬28-29
• 1.5.1 原理28
• 1.5.2 实验分组及处理28
• 1.5.3 BAPTA-AM及A23187分别对SKOV3细胞自噬的影响28-29
• 1.6 流式细胞术检测SKOV3细胞凋亡29-30
• 1.6.1 原理29
• 1.6.2 细胞接种及培养29
• 1.6.3 细胞分组及处理29-30
• 1.7 MTT法测定顺铂、BAPTA-AM及A23187联合顺铂对SKOV3细胞生长的影响30-31
• 1.7.1 MTT法的原理30
• 1.7.2 实验分组及处理30-31
• 1.7.3 BAPTA-AM及A23187分别联合顺铂对SKOV3细胞生长的影响31
• 1.8 统计学方法31-32
• 结果32-36
• 2.1 SKOV3细胞中GRP78对Beclin1、Bcl-2、CHOP mRNA表达的影响32-33
• 2.2 SKOV3细胞中GRP78对Beclin1、Bcl-2、CHOP蛋白表达的影响33-34
• 2.3 GRP78对SKOV3细胞自噬的影响34
• 2.4 GRP78对SKOV3细胞凋亡的影响34-35
• 2.5 BAPTA-AM、A23187对SKOV3细胞顺铂敏感性的影响35-36
• 讨论36-45
• 3.1 GRP78与内质网应激36-37
• 3.2 GRP78在细胞自噬中的作用37-39
• 3.3 GRP78在细胞凋亡中的作用39-43
• 3.4 GRP78对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响43-45
• 结论45-46
• 参考文献46-51
• 发表论文和参加科研情况说明51-52
• 综述 细胞自噬及自噬相关基因Beclin1与卵巢癌52-63
• 综述参考文献58-63
• 致谢63

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