B4GALT3受miR-27a上调并促进宫颈癌细胞的恶性行为

发布时间：2017-06-30 10:05

  本文关键词：B4GALT3受miR-27a上调并促进宫颈癌细胞的恶性行为，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的宫颈癌(Cervical cancer)是世界范围内女性肿瘤诊出率较高的疾病,死亡率居于第4位。尽管预防性的HPV疫苗和传统的子宫颈涂片检查能够降低宫颈癌的发生率和死亡率,但由于晚期诊断和常规治疗抵抗的发生,每年仍有大量女性死于该病。因此,确定能够预测临床结果并设计有力治疗方案的分子标志物至关重要。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码小RNA,它能够调节基因表达,涉及到多种细胞通路的调节,包括癌前病变进展至侵袭和转移的过程。研究表明,miRNA在正常代谢和细胞内环境稳态中发挥重要功能,因此,这些分子的功能失调与人类疾病密切相关。β-1,4-多聚乙酰氨基乳糖酶III(B4GALT3)属于B4GALT家族,它能催化多聚N-乙酰氨基乳糖的生成并与肿瘤的发生有关。然而,B4GALT3的上调机制以及它在宫颈癌中的作用尚不清楚。本研究旨在探究B4GALT3对宫颈癌细胞恶性行为的影响及其上下游调控的机制从而阐明B4GALT3在宫颈癌发生中的作用,为寻找治疗宫颈癌的分子标记物提供理论基础。方法首先运用RT-qPCR技术检测了宫颈癌组织和邻近癌旁组织中B4GALT3的表达量。其次,运用划痕实验、transwell迁移和侵袭实验、Western blot实验检测了B4GALT3对宫颈癌细胞迁移、侵袭能力以及EMT进程的影响。接着我们运用生物信息学方法预测了能够靶定B4GALT3的miRNA,并通过RT-qPCR实验、Western blot实验检测了miR-27a异常表达对B4GALT3 mRNA水平和蛋白水平的影响,同时用EGFP和luciferase荧光报告载体系统进一步验证二者的直接靶定关系。随后我们通过mRNA和蛋白降解实验检测了miR-27a上调B4GALT3的机制,同时我们检测了miR-27a对宫颈癌细胞恶性表型的影响、敲降B4GALT3对miR-27a引起的恶性表型的挽救作用以及封闭miR-27a对B4GALT3致癌活性的影响。最后,我们运用蛋白降解实验检测了B4GALT3对β1-integrin蛋白稳定性的影响。结果与邻近正常宫颈组织相比,B4GALT3在宫颈癌组织中高表达。B4GALT3高表达能够促进宫颈癌细胞系HeLa和C33A的迁移、侵袭和EMT进程。为探索B4GALT3的失调机制,我们预测了其上游的miRNA。EGFP和p GL3-promoter报告系统表明:miR-27a结合B4GALT3的3’UTR区并促进它的表达。RT-q PCR实验表明,miR-27a在宫颈癌组织当中也高表达并与B4GALT3的表达量呈正相关。miR-27a并不影响B4GALT3 m RNA和蛋白的稳定性。miR-27a高表达引起宫颈癌细胞系He La和C33A恶性行为的发生。而封闭miR-27a能够抑制这些恶性行为的发生。而且,敲降B4GALT3能够削弱miR-27a的致癌活性,封闭miR-27a能够削弱B4GALT3的致癌活性。这表明,miR-27a通过上调B4GALT3进而促进宫颈癌细胞的恶性行为。此外,我们还发现B4GALT3能够明显促进β1整合素(β1-integrin)的稳定性,并通过该通路影响B4GALT3对宫颈癌细胞的迁移和侵袭作用。综上所述,B4GALT3受miR-27a上调并通过β1-integrin通路促进宫颈癌细胞的恶性行为,有可能成为宫颈癌治疗的潜在标志物。结论B4GALT3受miR-27a上调并通过增强β1-integrin的蛋白稳定性促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭。
【关键词】：B4GALT3 miR-27a EMT β1-integrin 宫颈癌细胞
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语11-13
• 前言13-17
• 研究现状、成果13-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、B4GALT3能够促进宫颈癌细胞的恶性行为17-42
• 1.1 对象和方法17-32
• 1.1.1 实验材料17-19
• 1.1.2 实验方法19-31
• 1.1.3 统计学处理31-32
• 1.2 结果32-41
• 1.2.1 B4GALT3在宫颈癌组织中高表达32
• 1.2.2 过表达和敲降B4GALT3在RNA水平上是有效的32-34
• 1.2.3 过表达和敲降B4GALT3在蛋白水平上是有效的34-35
• 1.2.4 B4GALT3并不影响宫颈癌细胞的细胞活性35-36
• 1.2.5 B4GALT3并不影响宫颈癌细胞的增殖能力36-37
• 1.2.6 B4GALT3能够促进宫颈癌细胞的相对迁移速率37
• 1.2.7 B4GALT3能够促进宫颈癌细胞的迁移能力37-38
• 1.2.8 B4GALT3能够促进宫颈癌细胞的侵袭能力38-39
• 1.2.9 B4GALT3能够促进宫颈癌细胞的EMT进程39-41
• 1.3 小结41-42
• 二、B4GALT3受miR-27a上调42-58
• 2.1 对象和方法42-51
• 2.1.1 实验材料42
• 2.1.2 实验方法42-51
• 2.2 结果51-57
• 2.2.1 B4GALT33’UTR与miR-27a种子序列互补配对图51
• 2.2.2 miR-27a在宫颈癌组织中高水平51-52
• 2.2.3 宫颈癌组织中miR-27a和B4GALT3表达水平呈正相关52
• 2.2.4 过表达和封闭miR-27a有效性的验证52-53
• 2.2.5 miR-27a能够促进宫颈癌细胞中B4GALT3 mRNA的表达53-54
• 2.2.6 miR-27a能够促进宫颈癌细胞中B4GALT3蛋白的表达54-55
• 2.2.7 pcDNA-EGFP荧光报告载体系统证实B4GALT3受miR-27a上调55-57
• 2.3 小结57-58
• 三、miR-27a通过促进B4GALT3的转录过程提高其表达水平58-63
• 3.1 对象和方法58-59
• 3.1.1 实验材料58
• 3.1.2 实验方法58-59
• 3.2 结果59-62
• 3.2.1 miR-27a不影响B4GALT3 mRNA的稳定性59-60
• 3.2.2 miR-27a不影响B4GALT3蛋白的稳定性60-62
• 3.3 小结62-63
• 四、miR-27a能够促进宫颈癌细胞的恶性行为63-69
• 4.1 对象和方法63-64
• 4.1.1 实验材料63
• 4.1.2 实验方法63-64
• 4.1.3 统计学处理64
• 4.2 结果64-68
• 4.2.1 miR-27a能够促进宫颈癌细胞的迁移能力64-65
• 4.2.2 miR-27a能够促进宫颈癌细胞的侵袭能力65
• 4.2.3 miR-27a能够促进宫颈癌细胞的相对迁移率65-66
• 4.2.4 miR-27a能够促进宫颈癌细胞的EMT进程66-68
• 4.3 小结68-69
• 五、敲降B4GALT3挽救了miR-27a对宫颈癌细胞的致癌效应69-79
• 5.1 对象和方法69-70
• 5.1.1 实验材料69
• 5.1.2 实验方法69-70
• 5.1.3 统计学处理70
• 5.2 结果70-78
• 5.2.1 敲降B4GALT3能够挽救miR-27a对宫颈癌细胞迁移率的促进作用70-71
• 5.2.2 敲降B4GALT3能够挽救miR-27a对宫颈癌细胞迁移能力的促进作用71-72
• 5.2.3 敲降B4GALT3能够挽救miR-27a对宫颈癌细胞侵袭能力的促进作用72-73
• 5.2.4 敲降B4GALT3能够挽救miR-27a对宫颈癌细胞EMT进程的促进作用73-75
• 5.2.5 封闭miR-27a能够削弱B4GALT3诱导的致癌效应75-78
• 5.3 小结78-79
• 六、B4GALT3 抑制β1-integrin 蛋白的降解79-83
• 6.1 对象和方法79-80
• 6.1.1 实验材料79
• 6.1.2 实验方法79-80
• 6.2 结果80-82
• 6.2.1 B4GALT3能够促进宫颈癌细胞中β1-integrin的表达80-81
• 6.2.2 B4GALT3抑制宫颈癌细胞中β1-integrin的降解81-82
• 6.3 小结82-83
• 讨论83-85
• 结论85-86
• 参考文献86-92
• 发表论文和参加科研情况说明92-93
• 综述93-102
• 综述参考文献99-102
• 致谢102-103
• 个人简历103

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本文编号：501488