miR-335在肿瘤组织中的表达及其对宫颈癌增殖、转移的影响

发布时间：2017-08-05 18:32

  本文关键词：miR-335在肿瘤组织中的表达及其对宫颈癌增殖、转移的影响

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【摘要】：肿瘤是一种世界范围内的常见病、多发病,肿瘤组织在细胞形态和组织结构上,都与正常组织存在诸多差异。肿瘤致病因素主要有物理化学因素、病毒细菌因素、遗传因素以及分子生物学因素。其中,分子生物学基础与原癌基因、抑癌基因的异常表达和凋亡调节基因、DNA修复基因功能的紊乱密切相关。本质上肿瘤是一种基因疾病。microRNA (miRNA),又称微小RNA,是真核生物中存在的一类保守的非编码单链小RNA分子,长度约为21-25个核苷酸。它能与其靶标mRNA配对互补作用于mRNA,使它降解或抑制其翻译,从而发挥miRNA的调控基因表达作用。miRNA与生物体内众多生理功能有关,细胞的发育、分化、增殖和凋亡等生物学过程都受到miRNA的调控。近年来, miRNA成为研究热点,并己建立了庞大的miRNA数据库。随着生物信息学的发展,各种预测软件或在线网站为寻找miRNA靶基因提供了一种方便快捷的预测方法。基因芯片的产生和应用为基因功能研究带来了全新的契机,其高通量、快速、灵敏的特性大大提高了研究效率和准确性,也提供了海量数据供研究人员挖掘开发。随着对miRNA的深入研究,miRNA表达谱芯片己成为高通量检测分析不同细胞组织中的差异miRNA的重要工具,在肿瘤的miRNA研究中应用广泛。与基因芯片等大数据产生的同时,DNA、RNA、miRNA以及蛋白等的数据库和相关分析软件也逐渐建立并完善起来。为基因的功能研究、网络调控分析等提供了更多的信息,各种运算方法的不断改善也为生物信息学分析提高了准确性和可信度。多个研究表明,肿瘤的发生发展与众多miRNA调控机制密切相关。miR-335也与卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤相关,在不同肿瘤中扮演者癌基因或抑癌基因的角色。参与肿瘤的增殖、转移等生物学过程的调控,还与信号通路等基因的调控网络相关。基于miR-335在多种肿瘤中都发现具有一定的影响,因此我们推测miR-335在肿瘤的致病机制中占据重要作用。采用生物信息学方法分析miR-335序列保守性推测miR-335在物种进化中的作用,结合miRNA的调控机制,进一步预测其调控靶基因,再针对靶基因集合分析基因可能参与的生物学功能和调控的信号转导通路,以期明确miR-335在肿瘤中的作用方向,为后续实验深入研究提供一定的方向。根据生物信息学方法对miR-335的分析结果,我们最终选取数据集中较为特殊的宫颈癌作为研究目标发展实验研究。宫颈癌是女性高发性癌症,严重危害女性健康。在全球妇科病中是仅次于乳腺癌的第二高致死率癌症,每年有超过50万妇女确诊为宫颈癌,在发展中国家死亡率更是高达85%。在中国,每年约有50,000妇女因患宫颈癌死亡。目前治疗宫颈癌的方法主要是手术治疗,放化疗等传统治疗以及基因治疗、靶向治疗等新型方法。寻找治疗靶基因仍然是预防、诊断宫颈癌的重要方向。为进一步研究miR-335在宫颈癌中的作用,我们首先收集了宫颈癌患者宫颈癌组织及癌旁组织制成的石蜡切片,采用实时荧光定量PCR技术检测miR-335在宫颈癌及癌旁组织石蜡切片中的表达量。体外细胞实验选取宫颈癌HeLa细胞进行,使用化学合成的miR-335模拟物以及抑制物miR-335 mimics和miR-335inhibitor及其对照组mimics NC和inhibitors NC转染入HeLa细胞。miRNA模拟物能有效增强细胞内miRNA的功能,而miRNA抑制物能有效抑制内源性成熟miRNA功能,高效长久的抑制miRNA活性,mimics NC和inhibitors NC采用21-23 nt 2’-甲氧修饰的RNA寡核酸设计,可消除非序列特异性的作用效应,从而全面了解mimics或inhibitor以及背景效应之间的异同。人为改变HeLa细胞miR-335表达水平后,对细胞进行增殖、周期、侵袭、迁移等多种生物学行为的检测,揭示miR-335在宫颈癌的发生发展中的作用。本课题的研究成果将为后期深入研究miR-335在肿瘤中的调控机制提供新的方向和思路。并加深我们对宫颈癌发病机制的了解,为寻找新的诊断、治疗宫颈癌的潜在靶点提供新线索。方法：1.从miRNA分子数据库miRBase中查找miR-335在多个物种中的成熟序列,并进行序列比对分析,根据各物种miR-335的碱基序列相似程度分析miR-335在物种中的保守性。2.从NCBI数据库GEO中检索常见肿瘤疾病miRNA表达谱芯片数据集,选择包含肿瘤组织与癌旁组织分组并有miR-335表达数据的数据集作为后续研究数据集。将数据集导入芯片数据分析软件Qlucore Omics Explorer (QOE) 3.0,对数据进行标准化处理,选择适当统计学检验方法筛选差异表达miRNA,并进一步分析miR-335各肿瘤组织中的表达水平。3.分别在DIANA-microT、PicTar、miRDB和TargetScan等在线预测miR-335的靶基因,取各个预测结果交集。查询miRTarBase及文献报道中经实验验证的靶基因,与预测靶基因取并集作为后续分析的miR-335靶基因集合。4.在线使用DAVID上传miR-335靶基因集合,选择人类全基因组为背景,对其靶基因集合进行功能富集分析(GO-analysis)和信号转导通路富集分析(KEGG Pathway analysis)。5.在生物信息学分析的基础之上,选取宫颈癌为后期研究对象。首先搜集19组病理学确诊为宫颈癌的患者宫颈癌组织及癌旁组织制成的石蜡切片,采用qRT-PCR实验检测这19组宫颈癌及癌旁组织石蜡切片中miR-335表达量,并对检测结果进行统计学分析比较miR-335在宫颈癌及其癌旁组织的表达水平差异。6.在得到miR-335在宫颈癌及其癌旁组织的表达水平差异后,结合生物信息学分析结果,选取宫颈癌HeLa细胞作为后续体外实验对象,研究miR-335宫颈癌HeLa细胞生物学行为的影响。宫颈癌HeLa细胞分别转染化学合成的miR-335模拟物miR-335 mimics和miR-335模拟物抑制物miR-335 inhibitor及其对照组mimics NC和inhibitors NC,达到上调或下调miR-335表达水平目的。同时使用FAM标记的miRNA转染HeLa细胞作为阴性对照组,初步观察转染效率。通过qRT-PCR实验检测转染后的HeLa细胞中miR-335表达量变化进一步验证细胞的转染效果。7. HeLa细胞转染后通过CCK8实验检测各组细胞的OD值变化,反映细胞的增值能力；通过细胞流式检测各组细胞的周期分布变化。讨论miR-335高表达或低表达后对HeLa细胞增殖的影响。8. HeLa细胞转染后通过Transwell实验侵袭实验和迁移实验检测各组细胞侵袭或迁移的细胞数,反映细胞的侵袭和迁移能力；通过细胞划痕实验检测各组细胞在24h,48h的迁移率,反映细胞的迁移能力。讨论miR-335高表达或低表达后对HeLa细胞侵袭和迁移的影响。结果：1.在miRBase中共查询到大鼠、小鼠、家犬等12个物种中的成熟序列,通过序列比对发现在这12个物种中miR-335的碱基序列高度相似,说明miR-335在物种间具有高度的保守性。2.根据检索条件,从GEO中获得了肝癌(GSE31383)、肺癌(GSE48414)、乳腺癌(GSE38167)、肝内胆管癌(GSE53870)、脂肪肉瘤(GSE45364)、宫颈癌数据集(GSE303656)共6个符合要求的miRNA表达谱芯片数据集。将数据集导入Qlucore Omics Explorer (QOE) 3.0分析发现,miR-335在肝癌、肺癌、乳腺癌、肝内胆管癌、脂肪肉瘤肿瘤组织中的表达均与癌旁组织存在表达差异,且表达水平均为下调,差异倍数分别为0.32、0.07、0.19、0.93、0.58,差异均有统计学意义(P0.05)；miR-335在宫颈癌组织中亦存在表达差异,但表达水平呈上调趋势,差异倍数分别为1.10,差异有统计学意义(P0.05)。3.使用DIANA-microT、PicTar、miRDB和TargetScan在线网站预测miR-335靶基因,所得靶基因数目分别为166、137、251和2308个,这些靶基因取交集共有8个。在miRecords中查询经实验验证和PubMed相关文献中经证实的miR-335靶基因分别为15个、20个。三者结果取并集共有34个靶基因作为后续研究。4.对miR-335的34个靶基因集合做GO分析和KEGG分析,结果显示,miR-335靶基因功能富集于细胞迁移、凋亡和转录调控以及蛋白分子连接、细胞骨架组成等生物学过程和分子功能(P0.05)；主要参与了轴突向导和黏着斑信号通路、黑素瘤疾病信号通路以及TGF-beta信号通路(P0.05)。5.在19组宫颈癌组织与癌旁组织石蜡切片的qRT-PCR实验统计结果表明,有17对组织中miR-335在宫颈癌组织中较癌旁组织中显著低表达,2组宫颈癌组织中的miR-335表达水平高于癌旁组织。miR-335在宫颈癌组织的表达水平均值显著低于癌旁组织,差异倍数为0.287,差异具有统计学意义(t=-6.169,P0.001)。6. HeLa细胞转染FAM标记的miRNA 6h后于荧光倒置显微镜下观察,可见细胞内有绿色荧光,覆盖率约为80%。进一步采用qRT-PCR实验检测HeLa细胞转染miR-335 mimics和miR-335 inhibitor及其对照物mimicsNC和inhibitors NC后各组miR-335的表达水平。结果表明,转染miR-335mimics组表达量相对mimics NC组明显升高,差异倍数180.046,差异具有统计学意义(t=15.825, P=0.004); miR-335 inhibitor转染组表达量较inhibitor NC组表达量明显降低,差异倍数0.458。差异具有统计学意义(t=-8.292, P=0.030)。HeLa细胞转染miR-335 mimics和miR-335 inhibitor能有效提高或降低细胞内miR-335表达水平。7.CCK-8检测结果表明HeLa细胞转染后各组细胞增值情况在分组和时间上均具有显著性差异,且存在时间和分组交互效应。上调HeLa细胞miR-335表达后从第2天起细胞增殖速度明显降低(t=-10.252,P=0.001)；下调HeLa细胞miR-335表达则从第2天起细胞增殖速度明显加快(t=22.396,P0.001)。流式细胞检测结果表明上调HeLa细胞miR-335表达后,细胞周期在G0/G1期所占百分明显减少(t=-22.734,P=0.002),而在S期细胞所占百分明显增加(t=6.707,P=0.003),差异有统计学意义。8. Transwell实验侵袭实验和迁移实验结果显示,miR-335 mimics组的细胞穿膜数量均相比mimics NC组显著减少(P0.05),而miR-335 inhibitor组细胞穿膜数量均相比inhibitor NC组显著增多(P0.05),差异有统计学意义。细胞划痕实验结果显示,miR-335 mimics组的细胞在24h,48h细胞迁移率均显著低于mimics NC组(P0.05),而miR-335 inhibitor组的细胞在24h,48h细胞迁移率均显著高于inhibitor NC组(P0.05),差异有统计学意义。结论：miR-335序列在不同物种间具有高度保守性,其表达水平在肝癌、肺癌、乳腺癌、肝内胆管癌、脂肪肉瘤等多种肿瘤中异常低表达。miR-335靶基因涉及多个生物学过程和信号转导通路,与肿瘤的发生发展密切相关。miR-335在宫颈癌组织中低表达,转染miR-335 mimic可抑制HeLa细胞增殖、侵袭、和迁移,细胞阻滞于S期；转染miR-335 inhibitor可促进HeLa细胞增殖、侵袭和迁移。
【关键词】：miR-335 生物信息学 宫颈癌 细胞增殖 细胞转移
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-22
• 第一章 miR-335在肿瘤组织中的表达及其预测靶基因的生物信息学分析22-36
• 1.1 材料与方法22-25
• 1.2 实验结果25-31
• 1.3 讨论31-36
• 第二章 miR-335对人宫颈癌HeLa细胞增值、转移的影响36-60
• 2.1 材料与方法36-45
• 2.2 实验结果45-55
• 2.3 讨论55-60
• 参考文献60-68
• 英文缩略词表68-71
• 攻读学位期间成果71-72
• 致谢72-73

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本文编号：626404