HPV分型环介导核酸等温扩增检测技术研究
本文关键词：HPV分型环介导核酸等温扩增检测技术研究
【摘要】：人乳头瘤病毒(HPV)是一种DNA病毒,可以引起人类皮肤和粘膜的鳞状增生,感染该病毒会出现寻常疣和生殖疣等症状。经过多年的研究,科学家发现高危人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染是女性宫颈癌的主要诱因。由于HPV的分型较多,区分不同HPV亚型成了一个科研难点。因此,对HPV亚型尤其是高危亚型进行分型研究,对于分子流行病学的预防、控制措施制定以及指导治疗有着重要意义。目前,用于检测HPV基因分型的技术和平台众多,基于基因序列的分子水平检测技术是检测HPV病毒分型的主要方法,其中使用最广泛的是聚合酶链反应(PCR)。但由于该方法仪器昂贵并且耗时较长,因此不是最佳的检测方法。本文根据HPV病毒基因的相关序列,选取该病毒基因中包含较大差异片段的L1区,作为不同亚型的检测目标序列。构建重组标准质粒作为阳性对照标准品,开展HPV DNA可视化LAMP检测技术研究,区分其不同的亚型;并建立PCR-反向杂交与Taqman-qPCR检测方法,用以比对验证研究。本文应用环介导等温扩增技术(LAMP)检测25种不同亚型的HPV病毒,通过一系列反应参数的优化,建立LAMP反应体系。由于反应体系中加入了荧光染料——钙黄绿素,据此可根据反应前后的颜色是否发生变化来判断反应是否发生。添加了荧光染料的LAMP体系,可以通过肉眼的观察,直接得出阳性或阴性的结果,而不借助变温热循环仪器。基于这种效果,我们可将其作为可视化指示器。可视化LAMP体系的反应温度设为65℃,反应时间定为60 min,不同亚型检测限的平均水平可达到103拷贝数的数量级,并且亚型间不存在交叉反应。这一技术应用在450例临床样本上的符合率高达92.2%。本文将反向杂交方法作为一种对照的分子诊断方法。该方法作为分子诊断市场主流产品应用的核心技术,可以实现多重同时检测。实验结果显示,该方法的反应时间为3h,不同亚型检测限的平均水平也达到103拷贝数的数量级,并且亚型间不存在交叉反应。使用同样450例临床样本进行验证,反向杂交技术的检验符合率为98%。作为另一种对照技术,qPCR方法在分子诊断领域被冠以产业金标准。其检测限达到101拷贝数数量级,特异性良好。与qPCR方法相比,LAMP技术的仪器依赖性较低,并且达到了国家标准要求的检测限。与反向杂交技术相比,LAMP技术的操作相对简便,反应时间较短。此技术的应用,将大大减少人力物力的前期投入,为基因水平的快速检测,带来新的思路。作为一种效率高、成本低、准确度高的常规诊断工具,随着LAMP技术应用的日趋成熟,该技术在分子诊断领域的应用有着光明的前景。
【关键词】：可视化LAMP 实时 快速检测 HPV
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33;R440
【目录】：
- 致谢6-7
- 摘要7-9
- Abstract9-17
- 缩略词汇总17-18
- 1 绪论18-33
- 1.1 宫颈癌及其检测技术18-19
- 1.2 人乳头瘤病毒19-20
- 1.2.1 病毒概述19
- 1.2.2 病毒的致病性19
- 1.2.3 病毒的分类19-20
- 1.3 人乳头瘤病毒的检测研究进展20-21
- 1.3.1 基于细胞水平的检测20-21
- 1.3.2 基于分子水平的检测21
- 1.4 等温扩增检测技术21-28
- 1.4.1 LAMP技术方法概述21-22
- 1.4.2 LAMP技术反应原理22-24
- 1.4.3 LAMP引物设计原则24-26
- 1.4.4 LAMP方法的反应体系和反应条件26
- 1.4.5 LAMP反应的结果判断方法26
- 1.4.6 荧光指示剂钙黄绿素26-27
- 1.4.7 LAMP方法扩增核酸的优点27-28
- 1.4.8 LAMP方法的应用简介28
- 1.5 反向杂交检测技术28-30
- 1.5.1 反向杂交技术方法概述及基本特点28-29
- 1.5.2 反向杂交方法反应原理29
- 1.5.6 反向杂交方法扩增核酸的特点29
- 1.5.7 反向杂交方法的应用简介29-30
- 1.6 荧光定量PCR检测技术30-32
- 1.6.1 荧光定量PCR技术方法概述及基本特点30
- 1.6.2 荧光定量PCR方法反应原理30-31
- 1.6.3 荧光定量PCR方法扩增核酸的特点31
- 1.6.4 荧光定量PCR方法的应用简介31-32
- 1.7 本论文研究内容和意义32-33
- 1.7.1 本论文研究内容32
- 1.7.2 本论文研究意义32-33
- 2 HPV标准品的制备与鉴定33-48
- 2.1 实验材料、主要设备和仪器设备33-35
- 2.1.1 实验材料33-34
- 2.1.2 主要试剂34
- 2.1.3 仪器设备34-35
- 2.2 实验方法35-42
- 2.2.1 病毒DNA的提取35-36
- 2.2.2 基因序列分析和型特异性引物设计36-38
- 2.2.3 感受态细胞DH5а 的制备38
- 2.2.4 病毒阳性质粒的构建38-40
- 2.2.5 菌液测序和序列分析40-41
- 2.2.6 重组质粒的提取41
- 2.2.7 重组质粒浓度及拷贝数的换算41-42
- 2.3 实验结果42-47
- 2.3.1 目的片段电泳鉴定结果42-45
- 2.3.2 标准质粒测序鉴定45-47
- 2.4 小结与讨论47-48
- 3 LAMP体系的建立48-71
- 3.1 实验材料、主要设备和仪器设备48
- 3.1.1 实验材料48
- 3.1.2 主要试剂48
- 3.1.3 仪器设备48
- 3.2 实验方法48-52
- 3.2.1 LAMP引物的设计48-52
- 3.2.2 LAMP反应体系和反应条件52
- 3.2.3 LAMP反应的灵敏度实验操作52
- 3.2.4 LAMP反应的特异性实验操作52
- 3.3 实验结果52-71
- 3.3.1 LAMP体系的优化52-55
- 3.3.2 LAMP方法的特异性55-68
- 3.3.3 LAMP方法的灵敏度68-71
- 3.4 小结与讨论71
- 4 反向杂交体系的建立71-76
- 4.1 实验材料、主要设备和仪器设备71-72
- 4.1.1 实验材料71
- 4.1.2 主要试剂71-72
- 4.1.3 仪器设备72
- 4.2 实验方法72-75
- 4.2.1 反向杂交方法的探针设计72-73
- 4.2.2 反向杂交方法的反应体系和反应条件73-75
- 4.3 实验结果75
- 4.3.1 反向杂交方法的特异性75
- 4.3.2 反向杂交方法的灵敏度75
- 4.3.3 反向杂交方法的临床样本检测75
- 4.4 小结与讨论75-76
- 5 荧光定量PCR体系的建立76-81
- 5.1 实验材料、主要设备和仪器设备76
- 5.1.1 实验材料76
- 5.1.2 主要试剂76
- 5.1.3 仪器设备76
- 5.2 实验方法76-79
- 5.2.1 荧光定量PCR方法的Taqman探针设计76-78
- 5.2.2 荧光定量PCR方法的反应体系和反应条件78-79
- 5.3 实验结果79-81
- 5.3.1 荧光定量PCR方法的特异性79
- 5.3.2 荧光定量PCR方法的灵敏度79-80
- 5.3.3 荧光定量PCR方法的临床样本检测80-81
- 5.4 小结与讨论81
- 6 HPV病毒临床样本检测结果的比对分析81-83
- 7 总结、创新点与展望83-86
- 7.1 总结83-84
- 7.2 创新点84-85
- 7.3 课题展望85-86
- 参考文献86-90
- 附录90-103
- 1、反向杂交体系优化实验结果90-98
- 2、PCR-反向杂交方法特异性实验结果98-100
- 3、qPCR方法特异性实验结果100-103
- 作者简历103
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 祁丽亚;;外阴HPV感染患者中宫颈HPV分型检测分析[J];中国医疗前沿;2013年04期
2 周建风;;外阴HPV感染患者中宫颈HPV分型检测分析[J];中外医学研究;2012年02期
3 杨秀丽;宋丽君;陈淑葵;;HPV分型检测对宫颈病变的诊断价值[J];中国热带医学;2010年03期
4 吴文苑;段朝晖;方红辉;唐曙明;刘艾芹;;多重PCR法和HPV分型基因芯片法在高危型人乳头瘤病毒感染检测中的应用[J];国际检验医学杂志;2009年07期
5 施铮铮;杨孝军;许张晔;陈云琴;郑飞云;;外阴HPV感染患者中宫颈HPV分型检测[J];温州医学院学报;2008年05期
6 程艽;三组患有可能的HPV相关疾病妇女的HPV分型、细胞学和组织病理学所见[J];国外医学.妇产科学分册;1997年02期
7 金香蕊;;HPV分型检测在宫颈癌及其癌前病变筛查中的应用分析[J];健康研究;2014年03期
8 杜趁香;王焱;;HPV分型检测分析及其在宫颈病变中的意义[J];肿瘤防治研究;2011年04期
9 张鑫;;宫颈病变患者HPV分型检测的结果分析[J];当代医学;2012年09期
10 陈嘉雯;余丽;谈伙荣;欧阳丽莹;;HPV分型检测在产科中的应用[J];实验与检验医学;2014年03期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 王贵珍;董学君;郑专;陈建军;;荧光定量聚合酶链反应作HPV分型检测及结果分析[A];2006年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 马殙;HPV分型环介导核酸等温扩增检测技术研究[D];中国计量大学;2016年
2 支园园;6257例宫颈脱落细胞HPV分型检测结果分析及CIN患者LEEP后随访HPV的意义[D];辽宁医学院;2012年
，本文编号：631995
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/fuchankeerkelunwen/631995.html
