靶向SIRT1的小干扰RNA抑制宫颈癌C33A细胞增殖的实验研究

发布时间：2017-08-10 23:25

  本文关键词：靶向SIRT1的小干扰RNA抑制宫颈癌C33A细胞增殖的实验研究

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【摘要】：目的:通过在细胞水平研究SIRT1对宫颈癌C33A细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及其SIRT1与Notch信号通路相关蛋白的关系,探讨SIRTl在宫颈癌的发生发展中的作用。方法:以化学合成的靶向SIRT1基因的小干扰RNA(si RNA)转染C33A细胞,并分为四组:SIRT1-si RNA组、SIRT1阴性对照组、Lipofectamine?RNAi MAX组和空白细胞对照组。转染细胞72h后,分别提取各组细胞总RNA和蛋白,RT-PCR检测C33A细胞SIRT1 m RNA的表达,免疫印迹法检测C33A细胞中SIRT1、Notch1及Hes1等目的蛋白的表达,CCK-8法检测细胞增殖,分别应用Transwell细胞迁移实验及Transwell细胞侵袭实验检测C33A细胞的迁移及侵袭能力,流式Annexin V-PE双染法及Hoechst33258细胞核荧光染色法检测细胞凋亡。结果:RT-PCR结果表明:与空白细胞对照组及RNAi MAX组相比,SIRT1-si RNA组细胞SIRT1 m RNA表达明显下调(P0.05)。Western blot结果显示:与空白细胞对照组、SIRT1阴性对照组、RNAi MAX组相比,SIRT1-si RNA组细胞SIRT1蛋白表达量明显下调(P0.05),Notch1和Hes1蛋白的表达明显上调(P0.05)。CCK-8细胞增殖实验结果表明:SIRT1-si RNA组细胞增殖抑制率为53.1%,SIRT1阴性对照组细胞增殖抑制率为35.4%,RNAi MAX组细胞增殖抑制率11.5%,SIRT1-si RNA组细胞增殖抑制率明显高于其他组。细胞迁移及侵袭实验结果显示:与SIRT1阴性对照组、RNAi MAX组和空白细胞对照组相比,SIRT1-si RNA组穿过人工基底膜细胞数明显减少(P0.05)。流式细胞术结果表明:与SIRT1阴性对照组、RNAi MAX组和空白细胞对照组相比,SIRT1-si RNA组C33A细胞早期凋亡率明显增高(P0.05)。Hoechst33258染色显示:SIRT1-si RNA组C33A细胞核有明显改变,呈现亮蓝色荧光,并可见凋亡小体,而空白细胞对照组、SIRT1阴性对照组、RNAi MAX组细胞核呈均匀淡蓝色。结论:SIRT1 si RNA不仅能有效抑制C33A细胞的增殖、迁移及侵袭等,而且可诱导C33A细胞凋亡,可能与Notch-Hes信号通路密切相关。
【关键词】：SIRT1 宫颈癌 C33A细胞 Notch信号通路
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-7
• 引言7-8
• 第一章 材料与方法8-16
• 1.1 材料8
• 1.2 主要设备及仪器8
• 1.3 细胞培养8-9
• 1.3.1 细胞复苏8-9
• 1.3.2 细胞传代9
• 1.4 细胞转染9
• 1.5 Trizon法提取细胞RNA9-10
• 1.6 RT-PCR检测mRNA10-11
• 1.6.1 RNA逆转录为cDNA10
• 1.6.2 以cDNA为模板进行PCR扩增10-11
• 1.7 C33A细胞蛋白的提取11-12
• 1.7.1 细胞蛋白的提取11
• 1.7.2 BCA法测蛋白浓度11-12
• 1.8 Western检测目的蛋白12-13
• 1.8.1 SDS-PAGE电泳12
• 1.8.2 电转移12
• 1.8.3 免疫检测12-13
• 1.8.4 化学发光13
• 1.9 C33A细胞增殖检测13
• 1.10 C33A细胞迁移实验13-14
• 1.11 C33A细胞Transwell侵袭实验14
• 1.12 Annexin V-PE法检测细胞凋亡14
• 1.13 细胞核染色法检测细胞凋亡14-15
• 1.14 统计学分析15-16
• 第二章 结果16-24
• 2.1 RT-PCR半定量检测C33A细胞中SIRT1 mRNA表达水平16-17
• 2.2 Western Blot检测C33A细胞中SIRT1及其凋亡相关蛋白的表达水平17-18
• 2.3 细胞增殖检测结果18
• 2.4 SIRT1 siRNA对C33A细胞迁移能力的影响18-20
• 2.5 SIRT1 siRNA对宫颈癌C33A细胞侵袭能力的影响20
• 2.6 流式细胞术检测细胞凋亡20-22
• 2.7 Hoechst33258核染色检测细胞凋亡22-24
• 第三章 讨论24-26
• 小结26-27
• 参考文献27-29
• 综述29-39
• 综述参考文献36-39
• 攻读学位期间的研究成果39-40
• 致谢40-41

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 Pakhee Aggarwal;;Cervical cancer: Can it be prevented?[J];World Journal of Clinical Oncology;2014年04期

2 吴琦;于红;张文卿;;siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响[J];微生物学杂志;2014年03期

3 彭功玲;田野;逯，

本文编号：653210