Snail基因诱导绒癌细胞上皮—间质转化的研究

发布时间：2017-08-14 10:20

  本文关键词：Snail基因诱导绒癌细胞上皮—间质转化的研究

  更多相关文章： Snail基因 上皮-间质转化 绒毛膜癌 JEG-3细胞 E-cadherin N-cadherin

【摘要】：目的:绒毛膜癌(choriocarcinoma,CC),简称绒癌,是一种生长迅速的高度恶性肿瘤,以血行播散、转移早而广泛且对化疗敏感为主要特征。其发病机制至今仍尚不清楚。绒癌侵袭转移的发生及对化疗药物产生耐药性是造成患者死亡的主要因素。因此,如何抑制肿瘤细胞侵袭转移成为研究热点。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),是指在特定的生理或病理情况下,具有极性的上皮表型细胞发生细胞骨架重塑现象,侵袭及迁移能力增强,上皮细胞标志物E-cadherin及间质细胞标志物N-cadherin的表达改变,转化为具有活动能力的间质表型细胞的过程。越来越多的研究表明,EMT不仅是哺乳动物胚胎发育及器官形成的基础过程,还与多种上皮性恶性肿瘤的局部浸润以及远处转移密切相关。因此,进一步了解EMT分子调控机制及肿瘤发生发展机制,再通过各种技术干扰EMT的过程,有望为绒癌的治疗提供新方向。Snail基因首先在果蝇中发现,随后在多种脊椎动物包括人类中相继识别出Snail及其同源组织。Snail及其同源组织属于SNAIL家族,包括Snail、Slug、S1P1等。在对多种肿瘤的研究中发现,Snail基因通过抑制E-cadherin表达及促使N-cadherin表达,诱导EMT的发生,肿瘤细胞迁移、侵袭及转移能力增强。然而,Snail基因与绒癌细胞EMT的关系罕见报道。本实验通过体外培养绒癌JEG-3细胞,以转染Snail基因作为处理因素,观察细胞形态、迁移能力及EMT分子标记物的表达,旨在研究Snail基因在绒癌发生发展中的作用,并对其机制进行探讨,以期为绒癌的治疗提供新思路及理论依据。方法:1培养人绒毛膜癌JEG-3细胞株;2实验分组:①实验组,应用Lipofectamine?2000脂质体转染试剂转染p EGFP-N1-Snail质粒;②阴性对照组,转染空白质粒;③脂质体对照组,转染Lipofectamine?2000脂质体转染试剂;④空白对照组,无任何处理;3倒置相差显微镜:观察各组JEG-3细胞形态的变化;4细胞划痕试验:应用划痕试验评估各组JEG-3细胞的迁移能力;5 Real-time q PCR:检测各组JEG-3细胞转染48小时后Snail-m RNA的表达水平;6 Western blotting:检测各组JEG-3细胞中上皮细胞标记物E-cadherin、间质细胞标记物N-cadherin的表达情况;7应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,数据以均数±标准差(??±s)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),P0.05为无显著性差异,P0.05为具有显著性差异。所有实验结果均重复3次。结果:1倒置相差显微镜观察结果3组对照组JEG-3细胞形态多为椭圆形或圆形,细胞间排列紧密,聚集成片状生长,呈上皮样细胞形态;实验组JEG-3细胞形态转化成梭形,极性丢失,细胞间排列变松散,表现为间质样细胞特性。证实Snail基因促使绒癌JEG-3细胞向间质细胞转化,提高了绒癌JEG-3细胞的恶性侵袭力。2细胞转染效率的观察经Lipofectamine?2000脂质体转染法转染JEG-3细胞,并应用激光共聚焦显微镜观察转染效率。24h后实验组及阴性对照组中均有弱荧光表达(转染率15%~20%),48h后荧光表达均增强(转染率70%~80%)。脂质体对照组及空白对照组均无荧光表达。3细胞划痕试验结果显示划痕后细胞继续培养24h,显微镜下观察,实验组划痕愈合面积(47.32±2.32)%较空白对照组(14.9±1.21)%明显增加,P0.05,差异有统计学意义,提示Snail基因增强了JEG-3细胞迁移能力;划痕后12小时,实验组细胞增长速率为(13.04±0.72)%,空白对照组增长速率为(9.78±0.35)%,P0.05,差异无统计学意义,两组细胞增殖速度相似;划痕后24小时,实验组细胞增长速率为(19.13±1.07)%,空白对照组增长速率为(17.59±1.02)%,P0.05,差异无统计学意义,两组细胞增殖速度相似。三组数据比较提示实验组JEG-3细胞划痕愈合较快是由于转染Snail基因后细胞迁移能力增强,而非细胞生长加快的结果。4 Real-time q PCR检测转染48小时后各组JEG-3细胞Snail-m RNA的表达水平测定各组JEG-3细胞中Snail-m RNA的表达水平:实验组为2.067±0.031,阴性对照组为1.093±0.011,脂质体对照组为1.055±0.025,空白对照组为1.001±0.021。实验组Snail-m RNA的表达水平较阴性对照组、脂质体对照组和空白对照组明显上调,P0.05,差异有统计学意义;阴性对照组和脂质体对照相比,P0.05,差异无统计学意义。5 Western blotting检测转染48小时后各组JEG-3细胞E-cadherin及N-cadherin表达水平检测各组JEG-3细胞中E-cadherin的表达水平:实验组为0.268±0.034,阴性对照组为0.645±0.020,脂质体对照组为0.594±0.031,空白对照组为0.390±0.034。实验组E-cadherin蛋白的表达水平较阴性对照组、脂质体对照组和空白对照组明显下降,P0.05,差异有统计学意义,提示Snail基因可抑制JEG-3细胞E-cadherin的表达;3个对照组之间两两比较,P0.05,差异无统计学意义。检测各组JEG-3细胞中N-cadherin的表达水平:实验组为0.664±0.009,阴性对照组为0.578±0.030,脂质体对照组为0.576±0.013,空白对照组为0.581±0.020。实验组N-cadherin的表达水平较阴性对照组、脂质体对照组和空白对照组明显上调,P0.05,差异有统计学意义,提示Snail基因可上调N-cadherin的表达;3个对照组之间两两比较,P0.05,差异无统计学意义。结论:1 Snail基因改变了绒癌JEG-3细胞形态,使其呈现出间质细胞的表型特征,增加了细胞的恶性侵袭力。2 Snail基因提高了绒癌JEG-3细胞的迁移能力,促使绒癌发生转移。3 Snail基因诱导绒癌JEG-3细胞E-cadherin表达下降,N-cadherin表达上调,证实Snail基因通过EMT机制而参与了绒癌的发生发展过程。
【关键词】：Snail基因 上皮-间质转化 绒毛膜癌 JEG-3细胞 E-cadherin N-cadherin
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-15
• 材料与方法15-26
• 结果26-28
• 附图28-31
• 附表31-33
• 讨论33-36
• 结论36-37
• 参考文献37-40
• 综述 Snail基因与妇科恶性肿瘤上皮-间质转化的研究40-47
• 参考文献43-47
• 致谢47-48
• 个人简历48

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本文编号：672182