KLOTHO在人支气管上皮细胞炎症和氧化损伤中的作用及机制研究
本文关键词：KLOTHO在人支气管上皮细胞炎症和氧化损伤中的作用及机制研究
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【摘要】：【目的】人Klotho(KL)是一种对炎症和氧化损伤有保护作用的抗衰老蛋白,我们前期结果已经证明KL在人肺组织主要沿气道上皮分布,且KL蛋白含量在吸烟者和慢性阻塞性肺病患者肺组织中依次降低。本研究旨在进一步探索KL蛋白人气道上皮细胞中的表达、作用及相关调控机制。【方法】体外培养人支气管上皮细胞(16HBE),将香烟提取物(CSE)或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与细胞共培养,采用RT-PCR、蛋白印记(WB)及酶联免疫吸附测定(ELISA)方法分别检测KL的表达及分泌,研究吸烟及炎症对细胞内KL表达含量的影响;以小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)抑制对胞内KL基因转录,CSE或过氧化氢(H2O2)刺激16HBE,分别用实时定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)、酶联免疫吸附剂试验,Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测细胞因子(IL-8、IL-6、MCP-1)m RNA水平及蛋白分泌水平;流式细胞术衡量细胞氧化应激损伤和凋亡水平;同时免疫荧光、蛋白印记杂交(Western Blot是,WB)方法对KL相关通路进行探索。【结果】CSE和TNF-α能够抑制气道上皮细胞中KL的表达,并减少其分泌(P0.05),同时还伴随促炎因子释放增多(P0.05),核因子κB(NF-κB)通路抑制剂JSH23可明显逆转TNF-α的这种作用(P0.05);KL si RNA可显著降低细胞内KL的m RNA和蛋白表达水平,胞内炎症细胞因子(IL-8、IL-6、MCP-1)m RNA水平表达增加、细胞活力降低以及凋亡比率增加(P0.05);在CSE刺激下,胞内KL表达不足可提高炎症因子(IL-8)的表达和分泌水平,并加剧相关炎症通路(主要为NF-κB和ERK1/2通路)的异常活化(P0.05);此外,KL缺失的细胞对H2O2诱导的氧化损伤也更为敏感,表现为细胞活力降低、活性氧簇(ROS)产生增多以及细胞凋亡加剧(P0.05),这可能与蛋白激酶B(Akt/PKB)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)和p38 MAPK通路的异常活化以及细胞内抗氧化核转录因子NRF2过度消耗有关(P0.05)。【结论】在慢性阻塞性肺病形成过程中,气道上皮内KL表达降低参与了氧化应激、炎症、凋亡等重要病理过程。我们的结果不仅是对同领域研究成果的补充,并且为抑制加速衰老以及逆转COPD肺老化的自然发展开拓了新视野。
【关键词】：支气管上皮细胞 香烟 炎症 氧化应激 Klotho
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563.9
【目录】：
- 主要英文缩略语词表5-7
- 中文摘要7-9
- Abstract9-11
- 引言11-12
- 材料与方法12-22
- 结果22-34
- 讨论34-39
- 小结39-40
- 本研究的不足之处40-41
- 参考文献41-46
- 附录 综述46-59
- 参考文献53-59
- 在读期间文章发表情况59-60
- 致谢60
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