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MiR-146b对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的功能影响及机制研究

发布时间:2019-05-15 18:32
【摘要】:肺发育相关疾病如呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome, RDS)、支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)等是新生儿科的常见病、难治病,也是临床上早产儿、极低出生体重儿死亡的重要病因。RDS是由于肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)分泌不足所致,BPD主要是由于未成熟肺因感染、高氧等多种因素所致肺损伤并出现异常修复,而肺泡Ⅱ型上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell, AECII)的功能成熟是PS分泌和肺损伤修复的基础,因此,探索AECⅡ功能成熟及调控机制并在其中发现新的作用机制及干预靶点,对肺发育相关疾病的防治及药物研发等可能产生重要影响。AECII是哺乳动物肺泡上皮细胞的主要组成部分,与肺发育相关疾病有着密切联系。在功能上,AECII -方面可通过分泌肺表面活性物质,降低肺泡张力,保持肺的顺应性;另一方面,AECⅡ还可作为干细胞增殖转分化为肺泡I型上皮细胞(type Ⅰ alveolar epithelial cell, AECI),在肺损伤修复中发挥重要作用。此外,AECII在维持肺泡内外液体平衡及免疫调节方面也起着十分重要的作用。因此,AECII发育不成熟或功能缺陷会导致多种新生儿肺部疾病。目前,尚未建立用于长期研究的正常AECⅡ细胞株,而来自肺腺癌组织的A549细胞在功能上并不能完全替代正常的AECII,因而,目前用于研究的AECII大多由成年大鼠肺组织中分离培养而得。由于本课题组的主要研究方向是探讨新生儿尤其是早产儿肺部疾病,且孕19天胎鼠肺组织的生物学特性与早产儿肺组织生物学特性极为相似,能够满足本研究需要。故本课题第一部分主要研究了从孕19天胎鼠肺组织中分离培养AECⅡ的方法,并对分离培养的AECⅡ进行了一系列鉴定及分析,寻找其用于体外研究的最佳培养时期。MicroRNA (miRNA)是近年来发现的一类重要的短小内生RNA,它可通过对靶向mRNA的直接降解或抑制转录而阻止其翻译、表达,从而在转录后水平参与基因的表达调控。目前一致认为miRNA在细胞发育时序、细胞增殖、信号转导、干细胞分化和肿瘤的发生发展等生物过程中起着非常重要的作用。MiR-146b是一在脊椎动物中高度保守的miRNA,已有研究证实它在抑制肿瘤发展、细胞分化、增殖等多种生物过程中起着重要作用。在前期研究中,我们发现miR-146b在胎肺发育晚期不同阶段的表达具有显著差异性,而胎肺发育晚期是AECII逐渐成熟并开始具有功能的关键时期,因此,我们推测miR-146b可能对AECII的成熟和功能发挥有一定影响。为此,我们构建了过表达miR-146b的AECI I,检测其对AECII曾殖、转分化、表面活性物质相关蛋白(surfactant proteins, SPs)表达的影响,并初步探索了其潜在的作用靶标,为揭示新生儿肺发育相关疾病的发生机制提供了新的理论依据。第一部分胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养及ABCA3表达变化的研究目的: 观察原代培养胎鼠AECⅡ的生长状况及特异性蛋白ATP结合盒转运蛋白A3 (ATP binding cassette transporter A3, ABC A3)在不同时间的表达变化,为新生儿肺发育及肺部疾病发生机制的相关研究提供一些实验依据。方法: 首先采用胰酶联合胶原酶消化肺组织,并以差速离心及差速贴壁法纯化细胞;随后分别应用电子显微镜鉴定AECⅡ细胞;应用倒置相差显微镜观察不同时间点细胞生长状态;并且采用MTT法绘制细胞生长曲线;应用免疫荧光技术观察ABCA3在不同时间点动态表达变化。结果: 电镜下观察到AECⅡ内特征性板层小体大小及数量不等,胞膜外缘分布有刺状微绒毛;应用MTT法测得铺板后第24h、36h、48h、72h、96h、120h的OD值分别为0.177±0.009,0.193±0.011,0.212±0.019,0.253±0.019,0.243±0.012,0.192±0.011。光学显微镜下可见AECⅡ细胞形态随时间变化而逐渐拉长,变扁平,细胞内颗粒逐渐减少。免疫荧光示ABCA3表达随时间变化而逐渐下降。结论: 原代培养的胎鼠AECⅡ在培养早期(即培养72h以内)生长状况最佳,ABCA3表达最丰富,提示培养早期为研究胎鼠AECⅡ功能及影响机制较为理想的时间段。第二部分MiR-146b过表达对肺泡Ⅱ型上皮细胞的功能影响及机制研究目的:探讨miR-146b对原代培养AECⅡ生理功能的影响及其潜在的调控机制,为新生儿肺发育调控机制的深入研究提供一些理论依据。方法:首先我们构建了包含大鼠miR-146b前体序列及两侧侧翼序列的miR-146b腺病毒表达质粒载体pAd-GV275 CMV-rno-mir-146b,然后在HEK293T细胞中包装表达miR-146b的腺病毒及不表达miR-146b的对照腺病毒,再分别感染原代培养的AECII,以等量不含病毒的转染试剂转染的AECII作为空白对照。用real-time PCR法验证过表达效果后,分别用MTT法、免疫荧光法、real-time PCR和western blot法检测这三组细胞的增殖、转分化、部分SPs和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)表达等的差异性。结果:在AECⅡ培养的第48h和72h时,过表达miR-146b组的细胞增殖较空白对照组和阴性对照组有所降低(P0.05);但免疫荧光显示于AECⅡ培养的第5天,空白对照组和过表达miR-146b组ABCA3和水通道蛋白5 (aquaporin 5,AQP5)的表达无差异性。于AECⅡ培养的第3天,过表达miR-146b组细胞的SP-B mRNA表达较空白对照组和阴性对照组明显降低(P0.01),但SP-C mRNA和蛋白表达无明显差异(P0.05)。此外,在AECⅡ培养第3天时,过表达miR-146b组细胞的EGFR mRNA和其蛋白表达均低于两组对照组(P0.05)。结论:MiR-146b负向调控原代培养AEC Ⅱ的增殖和SP-B表达,且这种负向调控机制可能与miR-146b下调EGFR基因有关。
[Abstract]:Pulmonary development-related diseases such as respiratory distress syndrome (RDS), bronchopulmonary dysplasia (BPD), and the like are common diseases in the newborn, and it is also an important cause of the death of premature infants and very low birth weight infants. RDS is due to the insufficient secretion of pulmonary surfactant (PS), and the BPD is mainly due to the lung injury caused by various factors such as the infection of immature lung and high oxygen, and abnormal repair, while the type II alveolar epeithel cell, The functional maturation of AECII is the basis of PS secretion and lung injury repair. Therefore, it is necessary to explore the mechanism of AEC 鈪,

本文编号:2477709

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