Cortactin不同磷酸化位点在模拟气道剪应力作用下对气道黏液分泌的影响

发布时间：2020-03-25 20:14

【摘要】：目的:探究在模拟最适气道剪应力的作用下Cortactin不同关键磷酸化位点对MUC5AC分泌的影响。方法:(1)构建野生型CTTN的PTSB质粒,通过对CTTN基因(Cortactin gene,皮层肌动蛋白基因)主要关键酪磷酸化位点(Y421、Y470、Y486)进行定点突变,将原来酪氨酸残基替换为成丙氨酸(A),模拟相关位点非磷酸化状态。构建重组质粒PTSB02-GFP-CTTN-Y421A、PTSB02-GFP-CTTN-Y470A、PTSB02-GFP-CTTN-Y486A、PTSB02-GFP-CTTN,酶切鉴定并测序。(2)剪应力模拟装置参考Tarran等的实验研究,采用相位运动仪器,通过不断加速/减速交替进行的方式模拟人体呼吸过程中呼气与吸气的交替对气道上皮的剪应力作用。通过对调节加速/减速的时间和频率模拟病理状态下增大的剪应力和呼吸频率。为模拟病理状态下气流对气道上皮细胞的剪应力作用,本实验把加速/减速的参数设置为1.2 s/次,30次/min,作用35 min。(3)人支气管上皮细胞(16HBE)置于37℃、5%CO_2培养箱中培养,取状态好的细胞以5×10~5个细胞/孔种于6孔板中,置于37℃、5%CO_2培养箱中培养,待16HBE细胞生长至汇合度达70%左右时,随机分成6组:组(A)Y421A、组(B)Y470A、组(C)Y486A、组(D)野生型CTTN、组(E)空白质粒阴性对照、组(F)空白对照。使用lipo3000试剂转染16HBE细胞。孵育24 h后施予剪应力刺激,放回培养箱中继续孵育24 h后分析转染细胞,进行相关实验检测。(4)采用蛋白质免疫印迹(Western blotting,WB)检测Cortactin、p-Cortactin Y421、p-Cortactin Y470、p-Cortactin Y486蛋白相对表达水平;采用RT-PCR检测其Cortactin基因mRNA相对表达水平,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞外MUC5AC的相对分泌量。结果:(1)经基因测序及酶切鉴定,CTTN基因主要磷酸化位点(Y421、Y470、Y486)定点突变成功,成功构建重组质粒(PTSB02-GFP-CTTN-Y421A、PTSB02-GFP-CTTN-Y470A、PTSB02-GFP-CTTNY486A、PTSB02-GFP-CTTN),可用于后续实验。(2)通过Lipo3000试剂转染,荧光显微镜观察提示质粒转染成功,转染效率均达80%以上。(3)荧光定量PCR检测各组细胞中Cortactin基因mRNA的表达水平:与阴性对照及空白对照比较,各组质粒转染组细胞中Cortactin mRNA表达水平明显升高;各质粒转染组之间相比,各组表达Cortactin mRNA表达水平基本相同。(4)ELISA测定各组细胞MUC5AC胞外分泌量:A组中MUC5AC胞外分泌水平显著低于B组、C组、D组,差异均有统计学意义(P0.01),B组MUC5AC胞外分泌水平低于D组,差异均有统计学意义(P0.05),A组MUC5AC胞外分泌水平显著高于E组、F组,差异有统计学意义(P0.05),C组与D组,差异无统计学意义(P0.05),E组与F组,差异无统计学意义(P0.05)。(5)Western Blotting检测各组细胞中Cortactin蛋白及p-Cortactin Y421、p-Cortactin Y470、p-Cortactin Y486蛋白相对水平:与E、F组比较,A、B、C、D组Cortactin蛋白表达水平明显增高,各质粒转染组之间比较,Cortactin相对表达水平基本相同;与B、C、D组比较,A组p-Cortactin Y421蛋白相对表达显著降低;各组细胞中p-CortactinY470及p-CortactinY486的相对含量与胞外MUC5AC分泌无明显相关性。结论:模拟气道剪应力作用下Cortactin磷酸化位点Y421的磷酸化促进MUC5AC的分泌作用最强;Y470的磷酸化对MUC5AC的分泌有一定促进作用;Y486的磷酸化对MUC5AC的分泌几乎无作用。
【图文】：

遵义医科大学硕士学位论文 林宇斌131.3 实验方法1.3.1 实验流程图1.3.2 16HBE 细胞的培养操作前紫外消毒超净台试剂置于 37℃的水浴箱内平衡温度1.3.2.1 细胞复苏1）将保存于-80℃的冻存细胞取出。2）迅速放入 36℃～37℃水浴，不断轻轻小幅度晃动，使其急速融化，30 s-60 s内完成。3）将冻存管酒精消毒后，吸取细胞于离心管中，加入完全培养基。4）低速离心 1000 r/min 5 min，去上清后再加入 5 mL 培养基稀释，吹打均匀。人气道上皮细胞 16HBE 培养PTSB02-GFP-CTTN 重组质粒并扩增构建 Cortactin 磷酸化位点定点突变质粒，酶切并测序（Y421A、Y470A、Y486A）质粒转染 16HBE 细胞并培养Y421A Y470A Y486A野 生 型CTTN 组阴性对照组（转染空质粒）空白对照组（培养正常 16HBE）PCR 检测 Cortactin mRNA 表达水平，，ELISA 检测细胞外MUC5AC 分泌量，WB 分别检测内细胞内 Cortactin 及p-Cortactin Y421A、Y470A、Y486A 蛋白相对表达水平。施予剪应力作用

图 2 PTSB02-GFP-PURO 质粒Figure 2 PTSB02-GFP-PURO Plasmid 点突变据试剂盒说明书，配置如下 PCR 反应体系表 8 PCR 反应体系Table 8 PCR reaction system试剂 体积10× reaction buffer 5 μLSample plasmid （10 ng/μL） 2 μLForward primer (F) （10 pmol/μL) 1 μLReverse primer (R) （10 pmol/μL) 1 μLdNTP mixture（each 2.5 mM） 2 μLddHO 38 μL
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R56

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本文编号：2600388