Nrf2-ARE通路的激活改善香烟提取物作用下大鼠肺泡巨噬细胞的吞噬功能

发布时间：2020-03-30 01:21

【摘要】：研究背景 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种常见的以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病,气流受限呈进行性发展。与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关。根据世界卫生组织的报告,COPD是全球第三大死亡原因,2015年死亡人数达320万。COPD疾病的发生发展及其死亡率增加主要与吸烟有关。研究显示下呼吸道免疫细胞的功能降低使得病原体定植机率升高,从而促进COPD的发生发展~([1])。肺泡巨噬细胞作为下呼吸道免疫细胞的主要成员,其在COPD病程中吞噬下呼吸道病原体的能力减弱已得到国内外学者的认可~([2])。研究指出香烟烟雾的成分会通过促进肥大细胞表达蛋白酶丝氨酸成员S31(Prss31)促使肺泡巨噬细胞(Alveolar Macrophages,AM)的浸润,并向M2型极化,促进COPD疾病的进展并且香烟烟雾会诱导肺泡巨噬细胞自噬~([3])。因此寻找相应的抗氧化应激信号通路对抗香烟引起的氧化应激反应进而改善肺泡巨噬细胞的吞噬功能可作为治疗COPD一个新的研究方向。Nrf2-ARE通路是经典的抗氧化应激通路,但激活Nrf2-ARE通路能否修复香烟烟雾作用下肺泡巨噬细胞的吞噬功能和细胞内的活性氧目前尚不明确。因此,本研究探讨Nrf2-ARE信号通路途径在肺泡巨噬细胞对异硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的金黄色葡萄球菌的吞噬作用。研究目的 探讨Nrf2-ARE通路的激活是否能修复香烟刺激后肺泡巨噬细胞的吞噬功能及抗氧化应激作用。研究方法 1、细胞培养:大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)使用含20%胎牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的F-12K进行培养。2、香烟提取物的制备:点燃香烟提取物装置上的香烟。运用50ml注射器抽吸产生的负压作用将3支香烟燃烧产生的烟雾溶于20ml的F-12K培养液中。3、药物和香烟提取物对肺泡巨噬细胞的干预:设立空白对照组:普通培养基处理16h+24h。CSE刺激组:普通培养基处理16h+香烟提取物处理24h。药物干预组:2.5μmol/L的萝卜硫素和20μmol/L特丁基对苯二酚(tert-Butylhydroquinone,T-BHQ)处理16h+香烟提取物处理24h。4、肺泡巨噬细胞吞噬功能的检测:运用流式细胞仪检测各组肺泡巨噬细胞吞噬功能的差异。5、肺泡巨噬细胞活性氧的检测:运用流式细胞仪检测各组肺泡巨噬细胞的活性氧。6、免疫印迹法检测各组肺泡巨噬细胞核蛋白Nrf2的表达水平差异。7、细胞毒性的检测:运用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)检测药物及香烟提取物对肺泡巨噬细胞的毒性影响。研究结果 (1)与空白组相比,经香烟提取物刺激的肺泡巨噬细胞其吞噬功能明显下降(7001.66±559.47 VS 1508±349.6,P0.05)。(2)运用Nrf2-ARE通路的激活剂:萝卜硫素2.5μmol/L和特丁基对苯二酚20μmol/L干预后可明显减缓香烟刺激引起的肺泡巨噬细胞吞噬功能的降低(3034±272;;2753±160.1,P0.05)并降低细胞内的活性氧(67.93%±2.05%)VS(38.53%±1.22%)/(34.03%±2.27%),P0.05)。(3)Western印迹技术证实干预16h后,特丁基对苯二酚及萝卜硫素可促进肺泡巨噬细胞Nrf2的核蛋白表达(0.87±0.06)VS(2.12±0.03)/(2.80±0.06)。(P0.05)。(4)在香烟提取物作用下,肺泡巨噬细胞的吞噬功能与Nrf2核蛋白的表达量呈正相关(r=0.93,P0.05)。肺泡巨噬细胞活性氧含量与Nrf2核蛋白的表达量呈负相关(r=-0.942,P0.05),肺泡巨噬细胞的吞噬功能与细胞内活性氧含量呈负相关(r=-0.883,P0.05)。研究结论 Nrf2-ARE通路的激活可减缓香烟提取物刺激引起的肺泡巨噬细胞的吞噬功能下降并具有抗氧化应激的保护作用。
【图文】：

1 研究设计与方法本实验采用两独立样本 t 检验及 Pearson 相关分析统计学方法。使用含 20%胎牛血清和 1%双抗（青霉素和链霉素）的 F-12K 进行培养进行肺泡巨噬细胞（NR8383）的细胞培养。设立实验分组（空白对照组、香烟提取物（cigarette smoke extract，CSE）刺激组、萝卜硫素干预组及特丁基对苯二酚干预组），运用共聚焦显微镜观察吞噬情况，流式细胞仪分析吞噬功能和活性氧（reactive oxygen species,ROS）的表达情况。运用 Western 印迹技术分析经药物干预 16h 后 Nrf2 核蛋白在肺泡巨噬细胞中的表达情况。2 研究方法及流程2.1 研究流程

图 2 肺泡巨噬细胞在 200×显微镜下的形态素和特丁基对苯二酚可上调肺泡巨噬细胞 Nrf2 核蛋Western 印迹技术分析经药物干预 16h 后 Nrf2 核蛋白在肺泡巨n=3)（图 3）：各组 Nrf2/GAPDH 相对灰度值分别为：正常对香烟提取物组：（1.48±0.07）萝卜硫素组：（2.12±0.03），2.80±0.06）。特丁基对苯二酚和萝卜硫素处理 16h 后核蛋白异有统计学意义。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563.9

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 Dhulfiqar Ali Abed;Melanie Goldstein;Haifa Albanyan;Huijuan Jin;Longqin Hu;;Discovery of direct inhibitors of Keap1 Nrf2 protein protein interaction as potential therapeutic and preventive agents[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2015年04期

，

本文编号：2606808