转染HSG基因干预COPD气道成纤维细胞增殖的研究

发布时间：2020-04-23 05:25

【摘要】：目的: 免疫组化法检测大鼠细胞增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene, rHSG)蛋白在正常及慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)大鼠气道成纤维细胞细胞中的不同表达;通过体外转染(Homo hyperplasia suppressor gene,hHSG)基因至COPD气道成纤维细胞中,观察pEGFP-hHSG对成纤维细胞增殖的影响,为进一步基因治疗打下理论基础。方法: 通过制造COPD大鼠模型,组织块法培养气道成纤维细胞,用免疫组化检测rHSG基因在正常大鼠和COPD大鼠气道成纤维细胞中的表达;感受态细胞转化质粒pEGFP-n1、pEGFP-hHSG,碱裂解法抽提质粒,经电泳及DNA测序鉴定,然后通过脂质体法将pEGFP-hHSG质粒转染COPD患者气道成纤维细胞,荧光显微镜观察转染情况,转染后用免疫组化检测空白对照组(COPD未转染组)、转染pEGFP-n1组、转染pEGFP-hHSG组中hHSG蛋白的表达,MTT、细胞计数法观察转染后细胞生长状况。应用SPSSll.O软件对数据进行统计学分析,实验数据以?x±s表示。均数比较采用单因素方差分析,组间q检验, P0.05为差别有显著性统计学意义。结果: COPD造模成功后,经过细胞培养,免疫组化学结果显示rHSG蛋白在COPD大鼠组和正常大鼠组中皆有表达,其灰度值分别113.796±13.173、184.327±3.238,rHSG基因在COPD大鼠气道成纤维细胞中表达明显低于正常大鼠气道成纤维细胞中的表达,两者之间的差异具有统计学意义(P0.05)。原代培养正常人和COPD患者气道成纤维细胞,抗波形蛋白鉴定实验所得细胞为成纤维细胞,时差法纯化得到纯气道成纤维细胞;氯化钙法制备得到高转化率的感受态细胞(DH5a), pEGFP-n1、pEGFP-hHSG质粒转化、扩增,EcoI和SnaBI酶双酶切电泳鉴定得到片段长度约为2274bp的基因片段,测序结果证实质粒中含有hHSG基因编码区,其片段长为2274bp。经GeneBank Blast分析证实DNA插入序列与目的片段DNA序列完全完全一致。将pEGFP-n1、pEGFP-hHSG质粒转染至COPD气道成纤维细胞中,在银光显微镜可见转染组(pEGFP-n1、pEGFP-hHSG)细胞中皆有绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达,其主要位于细胞核周围。通过免疫组化方法检测得hHSG在空白组对照、pEGFP-n1、在pEGFP-hHSG三组细胞的细胞核及核周均呈现不同程度的阳性反应,其中空白对照组(未转染组)和转染pEGFP-n1组阳性反应较弱,而转染pEGFP-hHSG组细胞阳性反应较强,空白对照组、转染pEGFP-n1组与转染pEGFP-hHSG组所测灰度值比值具有统计学意义(P0.05),说明hHSG在这些细胞中均有不同程度的表达。细胞计数、MTT并描绘细胞生长曲线,结果示转染pEGFP-hHSG组细胞增殖受到明显抑制,而空白对照组和转染pEGFP-n1组细胞增殖无明显改变。转染pEGFP-hHSG组在第1、2、3、4、5天对COPD气道成纤维细胞增殖的抑制率分别为24.6% ,28.7% ,43.6% ,52.3%和62% ,且抑制率与时间呈正相关。转染pEGFP-hHSG组与空白对照组、转染pEGFP-n1组之间有明显差异(P0.05),而转染pEGFP-n1组与空白对照组之间无明显差异(P0.05)。结论: rHSG基因在COPD大鼠气道成纤维细胞中表达明显低于正常大鼠气道成纤维细胞中的表达。体外转染hHSG至COPD患者气道成纤维细胞后,hHSG在细胞核周边稳定表达,细胞增殖受到明显抑制。
【图文】：

支气管,大鼠,淋巴细胞,杯状细胞

的 COPD 病理改变（见图 1、2，3），提示造模成功。图 1 COPD 模型组大鼠 200× 支气管腔里见大量分泌物及炎性细胞，管壁的周围炎细胞浸润，杯状细胞增多，包体增大。

肺泡,杯状细胞,包体,支气管

图 1 COPD 模型组大鼠 200× 支气管腔里见大量分泌物及炎性细胞，管壁的周围炎细胞浸润，杯状细胞增多，，包体增大。图 2 COPD 模型组大鼠 400× 可见支气管壁淋巴细胞、浆细胞浸润，支气管粘膜上皮纤毛倒伏或脱落，杯状细胞明显增多，包体增大。
【学位授予单位】：贵阳中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R563.9

【参考文献】