虫草菌液对COPD气道上皮细胞的抗衰老作用及机制研究
发布时间：2020-05-28 22:32
【摘要】：研究背景慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种临床上常见的慢性呼吸道炎症性疾病,其典型表现为持续存在的呼吸道症状和气流受限,可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭,其发病率和死亡率逐年上升,在全世界范围内疾病死亡原因中排名第四位,2012年超过300万人死于COPD,预计到2020年将成为第三大致死性疾病。我国人口基数大,也是COPD高发病率国家之一,最新数据显示年死亡人数占全球慢阻肺死亡人数3 1.1%。COPD通常由空气中有害颗粒或气体暴露引起和/或肺泡发育异常而导致,慢性气道炎症和气道重塑是COPD患者的主要病理学特征。因此,目前COPD防治主要从上述两个方面作为锲入点,但临床治疗效果并不很理想。有研究发现,细胞衰老在慢性肺部疾病的发病机理中起着重要的作用,包括COPD、哮喘、肺癌以及肺纤维化等疾病。细胞衰老是所有细胞的基本属性,表现为在细胞应激的条件下出现细胞生长的停滞。一般来说,细胞衰老可以被看作是机体对抗癌症发生的一种保护机制。而另有研究发现,细胞衰老是一些慢性疾病的病理基础,例如大脑神经系统疾病(如阿尔茨海默氏症)、心血管系统疾病(如动脉粥样硬化)、肌肉骨骼系统疾病(如骨质疏松症)和COPD。细胞衰老过程与机体生理功能降低和蛋白质降解有关,其过程是不可逆转的。特别是细胞衰老通过减少造血干细胞的数量来影响再生能力,老化细胞释放许多细胞因子以进一步增强炎症反应,从而促进COPD患者的气道炎症和气道重构的发生发展。我们在前期的细胞实验中已经证明了 CSE诱导的COPD模型中细胞衰老是确实存在的。因此,细胞衰老可能存在于COPD患者的气道上皮细胞,并可能参与COPD的发生发展过程。然而,慢性阻塞性肺病的细胞衰老具体机制尚不清楚,需要进一步研究。从细胞衰老的角度研究COPD的早期预防及治疗,有效抑制COPD气道上皮细胞衰老的发生,可能会成为COPD临床治疗的新策略。冬虫夏草,又名虫草,在中国传统医学中已经被广泛使用。冬虫夏草中有许多生物活性成分,如虫草多糖、虫草素、甘醇类、氨基苯酚、麦角留醇等,都已在虫草中发现。从冬虫夏草中提取的化学成分具有多种药理活性,包括对肾脏的保护、肝脏的保护、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗凋亡等作用。在慢性阻塞性肺病患者中,人工培养的冬虫夏草可以抑制呼吸道的慢性炎症,改善肺功能,纠正气道Th1/Th2比例失衡,具有双向免疫调节作用,可以减轻呼吸肌疲劳,并能提高运动耐力。然而,尽管人工冬虫夏草的功效作用已被广泛应用于慢性阻塞性肺病的治疗过程中,但其对慢性阻塞性肺病细胞衰老的抑制作用的研究鲜有报道。在前期的细胞实验中,我们发现香烟提取物(CSE)可以诱导体外人支气管上皮细胞衰老,而人工冬虫夏草可以一定程度缓解由CSE引起的气道上皮细胞衰老。在此基础上,本研究将从体内、外实验对这个问题做进一步探讨。研究目的从细胞和动物实验水平观察虫草菌液对COPD气道上皮细胞衰老的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。研究方法搜集临床COPD患者肺组织,利用形态学方法(HE染色和免疫组织化学染色)证实COPD气道上皮细胞衰老的存在,并通过western blotting检测COPD患者肺组织P16、P21蛋白的表达水平;通过细胞实验利用SA-β-gal染色、BrdU染色、荧光定量PCR和western blotting确定CSE诱导人支气管上皮细胞(16HBE)合适的作用时间和浓度并成功制作16HBE烟熏模型,进而检测虫草菌液对体外16HBE烟熏模型P16、P21蛋白及mRNA表达水平的影响;利用脂多糖(LPS)气管内滴入和被动烟熏法成功制作COPD大鼠模型,通过形态学方法验证COPD模型构建成功;并通过免疫组织化学染色、荧光定量PCR和western blotting方法观察虫草菌液对COPD大鼠气道上皮细胞P16、P21蛋白及mRNA表达的影响,观察不同剂量的虫草菌液对COPD大鼠气道上皮细胞P16、P21蛋白及mRNA表达影响的差异性,并通过细胞实验检测BCL-2、P53、HSP90及HIF-1 α蛋白表达探讨其抗细胞衰老可能的作用机制。研究结果研究发现,在COPD患者的气道上皮细胞中,P16和P21蛋白及mRNA的表达水平均高于对照组,这是基于免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和western blotting检测的结果。我们在细胞实验发现CSE可以诱导16HBE细胞衰老,并证实CSE作用于16HBE的合适浓度为2.0%,合适作用时间为6h。虫草菌液可以缓解由CSE引起的细胞衰老,并发现虫草菌液治疗组的P16、P21蛋白及mRNA的表达低于CSE诱导细胞组,并可以促进16HBE细胞的增殖,差异有统计学意义。利用HE染色观察COPD模型大鼠肺组织病理性改变,证实COPD模型构建成功。实时荧光定量PCR及western blotting检测P16和P21的mRNA及蛋白表达水平,发现在COPD模型大鼠的气道上皮细胞中也有升高;与对照组比较有统计学意义;不同剂量虫草菌液治疗组大鼠肺组织P16和P21的mRNA及蛋白表达水平与COPD模型组比较,均存在明显降低,差异有统计学意义。BCL-2蛋白在三组16HBE细胞中均有表达,而在CSE组中的表达量最高,经过虫草菌液处理后表达减少(CSE+虫草菌液组),二者表达差异具有统计学意义。P53蛋白在CSE组16HBE细胞中的表达最高,CSE+虫草菌液组表达量次之,对照组表达量最低,三者差异具有统计学意义。HSP90蛋白在三个实验组中的表达趋势与BCL-2和P53相同;而HIF-1α蛋白在CSE组中表达最高,而在对照组和CSE+虫草菌液组的表达没有统计学差异。研究结论CSE可以诱导COPD气道上皮细胞发生细胞衰老;通过细胞实验和动物实验均证实虫草菌液对CSE诱导的COPD气道上皮细胞的衰老具有抑制作用,并可能通过抗凋亡途径P53/BCL-2/HSP90/HIF-1 α抑制COPD支气管上皮细胞衰老的发生。
【图文】：
逦山东大学博士学位论文逦逡逑结果逡逑１、Ｐ１６、Ｐ２１蛋白及ｍＲＮＡ在ＣＯＰＤ患者气道上皮细胞内的表达逡逑我们从ＣＯＰＤ患者气道组织ＨＥ染色切片（图１Ａ）上可以看到，气道上皮正逡逑常结构破坏，杯状细胞X椛⑾嗣狗⒒啄ぴ龊竦炔±砀谋洹＃校保都埃校玻泵忮义弦咦橹旧杉咴谄郎掀は赴陌思鞍诰斜泶铮ㄍ迹保拢诲义希茫希校幕颊咦榈谋泶锼礁哂诙哉兆椋钜煊型臣蒲б庖澹ㄍ迹保缅澹＃鳎澹螅簦澹颍睿猓欤铮簦簦椋睿珏义霞坝舛浚校茫曳椒觳饨峁崾荆校保都埃校玻钡牡鞍住ⅲ恚遥危帘泶锼皆冢茫希校淖殄义暇哂谡Ｗ椋钜煊型臣蒲б庖澹ㄍ迹保模迹保牛ｅ义希粒缅
本文编号：2685924
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