褪黑素对内毒素致大鼠急性肺损伤中p38MAPK信号通路的影响

发布时间：2020-06-29 17:36

【摘要】： 目的:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是临床常见的由感染等多种因素引起的弥漫性肺实质损伤,也是全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)或多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)在肺部的典型表现。ALI的发病的机制很复杂,迄今为止尚未完全阐明。以往的研究已证明,ALI的发生与机体肺部氧化/抗氧化平衡失调有直接关系,因为当肺脏受到各种致病因素(如创伤、休克、感染等)严重打击时,可导致肺脏局部产生剧烈的氧化应激反应,进而引起ALI。革兰氏阴性菌是临床引起气道和肺部炎症的重要病原之一,其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)成分介导炎症细胞如肺泡巨噬细胞、中性粒细胞以及内皮细胞等释放大量的促炎因子、炎性介质,此过程在炎症反应中起重要作用。然而,在炎症反应过程中,信号转导系统起着至关重要的作用。促分裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase,MAPK)介导的信号转导通路是生物信号引起核反应的重要通路,其家族主要有细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-jun氨基未端激酶(c-Jun-NH2-terminal kinase,JNK)、p38MAPK和ERK-5。其中p38MAPK信号通路与ALI关系密切,是参与炎症反应的细胞内的重要通路,p38MAPK通过非磷酸化转化为磷酸化状2态进而促进下游底物的磷酸化以实现信号转导,启动核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)等转录因子,从而促进炎症介质分泌,介导炎症反应。但是,关于p38MAPK信号通路活化及上游调控机制仍不清楚。实验表明, p38MAPK通路对机体有保护性作用。但由于TNF-α、IL-1持续高水平而导致的炎性过程可能同p38MAPK的过度激活有关,尤其在LPS诱导的多种细胞因子合成的信号转导中起到关键性作用。Beaty等实验表明p38MAPK途径介导了LPS作用的中性粒细胞内的信号转导, p38MAPK在LPS作用下被磷酸化活化,活化的p38MAPK即由胞浆进入胞核,转录生成大量的炎性因子。有研究已证明抑制p38MAPK途径,能够有效的抑制炎症反应,明显的减轻机体的炎症反应。褪黑素是已发现的具有强抗氧化应激作用的激素,但其作用与p38MAPK途径是否相关,国内外无相关文献报道,其机制尚有待研究。褪黑素最早认为对机体的生殖系统、内分泌系统、精神神经系统和生物节律等都有明显的调节作用,同时与睡眠、镇静等生物学行为有关。直到20世纪90年代初,Tan等首次报道MT具有抗氧化活性,是一种高效的内源性自由基清除剂,并在抗炎方面有积极的作用,所以,MT抗ALI机制研究仍然是目前的热点。但是,MT抗氧化抗炎作用的信号转导途径、生理水平MT在机体抗氧化抗炎防御体系中的地位和机制到目前仍未弄清楚,所以从分子水平去解决上述问题,为MT的广泛应用开辟更为广阔的前景。本课题通过气管内滴注LPS复制大鼠ALI模型,旨在在体实验探讨ALI和p38MAPK信号通路活化的关系及MT抗ALI机制,为MT的临床应用提供一定的理论和实验依据。方法:本实验采用气管内滴注LPS复制大鼠ALI模型,并通过腹腔给予MT,观察不同时间点丙二醛(malonaldehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、一氧化氮(nitrogen monoxidum, NO)、肺组织病理学改变及肺组织中p38MAPK蛋白的表达变化。将72只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重190~220克,随机分为3组,每组24只。①Control组:经气管滴注无热源生理盐水(NS),每只200μl,并在滴注前后30min分别腹腔注射(ip)溶媒(1%乙醇生理盐水)1ml/kg;②LPS组:经气管滴注LPS(200μg/200μl/只),并在滴注前后30min分别ip溶媒1ml/kg;③LPS+MT组:经气管滴注LPS(200μg/200μl/只),并在滴注前后30min分别ip MT 10mg/kg。各组动物分别于滴注LPS后3h、6h和10h经颈总动脉放血处死,同时留取肺部标本。肺部标本分为三部分:一部分制备匀浆检测MDA、SOD、NO的活性和含量变化;一部分观察其形态学变化,同时采用免疫组织化学染色和图像分析观察肺组织中p38MAPK蛋白的表达和分布;另一部分匀浆采用Western blot技术观察肺组织中p38MAPK蛋白的表达变化。数据均以均数±标准差(x±s)来表示,组间差异用单因素方差分析(one way ANOVA),有显著差异者用SNK-q检验进行两两比较,均以P0.05为有统计学意义。结果:1肺组织中MDA含量的变化:与Control组相应时间点比较,LPS组经气管内滴注LPS后3h、6h和10h肺组织中MDA含量显著升高(P均0.01),且10h时达到高峰,相邻时间点之间有显著差异(P均0.01);与LPS组相应时间点比较,LPS+MT组肺组织MDA含量明显降低(P均0.01),但仍高于Control组(P均0.01)。 2肺组织中SOD活性的变化:与Control组相应时间点比较,LPS组经气管内滴注LPS后3h、6h和10h肺组织中SOD活性显著降低(P均0.01),且10h时活性降到最低,相邻时间点之间有显著差异(P均0.01);与LPS组相应时间点比较,LPS+MT组肺组织SOD活性明显升高(P均0.01),但仍低于Control组(P均0.01)。 3肺组织中NO含量的变化:与Control组相应时间点比较,LPS组经气管内滴注LPS后3h、6h和10h肺组织中NO含量显著升高(P均0.01),且10h时达到高峰,相邻时间点之间有显著差异(P均0.01);与LPS组相应时间点比较,LPS+MT组肺组织NO含量明显降低(P均0.01),但仍高于Control组(P均0.01)。 4肺组织形态学观察:Control组肺泡结构清晰,壁薄,肺泡腔内无渗出液;滴注LPS后3h肺泡间隔明显增厚,肺泡萎陷及炎细胞浸润,6h时其结构已无法辨认,10h时改变更加显著;LPS+MT组3h改变同Control组,6h与10h时肺泡结构仍然存在,肺泡间隔略增厚,PMN浸润较LPS组明显减轻,肺泡腔内渗出不明显,但个别区域炎症改变较突出。 5肺组织免疫组织化学染色观察:Control组气道和肺组织可见反应较弱的p38MAPK阳性细胞,LPS组p38MAPK阳性细胞较对照组明显增多(10h时表达达到高峰,P0.05或P0.01),主要分布于浸润的炎症细胞、气道上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞。LPS+MT组气道和肺组织中阳性细胞分布与LPS组类似,但阳性信号明显减弱(10h时P均0.01)。 6肺组织Western blot分析发现:Control组可见肺组织p38MAPK蛋白有少量表达。LPS组各时间点与Control组相比,p38MAPK蛋白表达显著升高,10h时达到高峰,表现为p38MAPK与β-actin的IOD值的比值升高(P0.05或P0.01)。LPS+MT组各时间点与LPS组相比,p38MAPK蛋白表达下降,表现为p38MAPK与β-actin的IOD值的比值下降(P均0.05),但仍高于Control组。结论:1气管内滴注LPS可引起大鼠肺组织严重的炎症反应,说明成功地复制了ALI动物模型。 2 LPS诱发的大鼠急性肺损伤模型中,磷酸化p38MAPK在气道和肺组织内表达增加, p38MAPK的活化见于肺组织内多数细胞,提示肺内炎性和非炎性细胞均有p38MAPK信号分子的激活。 3 MT对ALI时的肺脏起明显的保护作用,其保护机制可能与MT的抗氧化作用和抑制p38MAPK信号通路的过度激活有关。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R563.8

【参考文献】