RNA干扰BCK1基因治疗卡氏肺孢子肺炎的体外实验研究

发布时间：2020-07-13 07:55

【摘要】： 本实验研究构建BCK1基因miRNA表达载体,转染体外提纯培养卡氏肺孢子(Pneumocystis carinii,PC),通过观察其包囊增殖情况,电镜下观察转染后PC超微机构变化以及RT-PCR观察BCK1基因受干扰情况,初步探讨RNA干扰技术对体外培养PC的抑制效果。方法:连续地塞米松皮下注射正常wistar大鼠6W,诱导卡氏肺孢子肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia PCP)动物模型;依据siRNA设计原则,结合PC BCK1基因序列特征,借助生物学信息学软件在线设计两对靶向PC BCK1基因的siRNA。应用基因重组技术构建BCK1基因短发价状siRNA质粒干扰载体。提纯并体外培养PC细胞,利用脂质体将siRNA转染入PC细胞,同时设立GFP转染对照组、空质粒转染对照组、未经任何处理空白阴性对照组。根据每日荧光显微镜下观察荧光个数,选用最优转染方法;采用GMS染色,计数每日包囊数变化情况,根据每隔1d PC包囊计数情况,对不同组别,观察d数及重复次数等各因素进行多因素方差分析,使用统计软件SPSS计算出F值。作用72h后扫描电镜观察空白组及重组质粒转染组PC虫体超微结构变化情况,RT-PCR检测转染前后PC BCK1基因表达变化情况。结果:成功建立卡氏肺孢子肺炎大鼠模型,成功构建2种BCK1siRNA真核表达载体,命名为BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2。转染体外培养PC经GMS染色并计数发现BCK1 siRNA能够影响体外培养PC包囊的增殖,与空白对照组相比,BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2对PC增殖抑制率分别为35.4%和42.5%。通过扫描电镜观察可见siRNA真核表达载体组PC超微机构出现不同程度细胞壁破损等改变。RT-PCR结果发现BCK1基因mRNA表达发生抑制,BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2对PC mRNA表达的抑制率分别为57.38%和64.45%。结论:BCK1 siRNA真核表达载体能通过有效干扰PC BCK1基因的复制和表达,并影响体外培养PC细胞的增殖,能够对PC细胞壁产生一定破坏作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R563.1
【图文】：

重组质粒,孔板,统计学,片断

轻柔混匀，室温放置 5min将两者混合，孔板中，每个比例组转染 8 孔。分别在转（放大 600 倍）观察荧光个数，每孔数数均数，使用统计学软件 SPSS 进行多因-shRNA1 和 BCK1-shRNA2 双酶切后凝RⅠ双酶切重组质粒pPC-MSG后产生28酶切后产生 2800bp 与 325bp 片断，凝胶1-shRNA1 和 BCK1-shRNA2 已被插入到1 2 3 4bp

测序,重组质粒,转染,转染效率

BCK1-shRNA2 测序结果图 2 重组质粒 BCK1-shRNA1，BCK1-shRNA2 测序结果Fig2 The DNA sequence of BCK1-shRNA1，BCK1-shRNA23.3 PCP 动物模型建立注射地塞米松六周后，动物出现食欲下降，毛色变暗，毛发脱落，呼吸加快，少动。此时剖杀大鼠，并作肺叶横断印片，GMS 染色可见大量卡氏肺孢子包囊。见图 33.4 细胞转染条件的优化按质粒与 Lipofectamin 按不同比例转染 PC 后分别在 24h，48h，72h 倒置荧光显微镜下观察每视野荧光个数，转染后不同时间其转染效率见表 1，结果表明：质粒转染 24h、48h、72h 比较，转染 48h 转染效率高于其他各组，差异有统计学意义（P<0.5）。质粒与脂质体质量体积比各组比较，当比例为 1:2 时，即质粒 2μg

转染,重组质粒,荧光

图 3 GFP 重组质粒转染 PC 24h 后荧光表达情况（×600）Fig 3 PC transfected with GFP recombinant plasmid after 24h图 3 GFP 重组质粒转染 PC48h 后荧光表达情况（×600）Fig 3 PC transfected with GFP recombinant plasmid after 48h

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