罗格列酮干预急性肺损伤疗效研究

发布时间：2020-07-17 09:19

【摘要】：第一部分罗格列酮对脂多糖诱导的急性肺损伤肺泡上皮细胞的作用研究目的:罗格列酮是一种过氧物酶体激活物受体γ(PPARγ)激动剂,本研究旨在探究罗格列酮对急性肺损伤中肺泡上皮细胞中的保护机制。方法:本研究分对照组、脂多糖(LPS)组和LPS+罗格列酮干预组。采用10umol/L的罗格列酮处理LPS刺激的A549细胞,通过CCK-8试验检测比较LPS以及罗格列酮干预对A549细胞活力的影响;通过流式细胞检测并比较LPS以及罗格列酮处理对A549细胞凋亡以及活性氧(ROS)水平的影响;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测LPS和罗格列酮处理A549细胞培养上清中α肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)以及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的水平。采用实时荧光定量PCR(real-timePCR)以及蛋白免疫印迹(Western blot)检测PPARγ,NF-κBp65、Bax、Bcl-2、NOX4 和 iNOS 的 mRNA 水平以及蛋白水平。结果:(1)采用l0ug/mlLPS处理A549细胞24、48和72小时,对A549细胞活力的抑制作用可分别达到12.03%,28.83%和41.50%。采用l0ug/mlLPS和10 umol/L罗格列酮处理A549细胞24、48和72小时,与单纯LPS处理组相比,A549 细胞活力分别增加 5.39%(p0.05)、17.27%(p0.01)和 24.39%(p0.01),差异具有统计学意义;(2)与对照组相比,采用10ug/mlLPS处理A549细胞48小时能够显著诱导细胞凋亡(7.62倍)。采用10ug/mlLPS和10umol/L罗格列酮处理A549细胞48小时,与单纯LPS处理组相比,A549细胞凋亡率减低58.22%,差异具有统计学意义(p0.01);(3)与对照组相比,采用10ug/mlLPS处理A549细胞48小时能够明显增加细胞内活性氧ROS的水平(1.73倍);采用10ug/ml LPS和10umo1/L罗格列酮处理A549细胞48小时,与单纯LPS处理组相比,A549细胞内活性氧ROS的水平显著降低45.63%,差异具有统计学意义(p0.01);(4)与对照组相比,采用10ug/mlLPS处理A549细胞,48小时后检测出A549细胞后TNF-α,IL-6和MCP-1的水平分别增加2.55、1.89以及1.25倍。采用10ug/ml LPS和10umol/L罗格列酮处理A549细胞48小时,与单纯LPS处理组相比,A549细胞培养上清液中TNF-α,IL-6和MCP-1的水平分别降低35.38%、30.76%和28.18%,差异具有统计学意义(p0.01);(5)与对照组相比,采用1Oug/ml LPS处理A549细胞48小时,能够显著增加NOX4和iNOS的mRNA表达水平4.82和2.66倍。采用10ug/ml LPS和10umol/L罗格列酮处理A549细胞48小时,与单纯LPS处理组相比,A549细胞NOX4和iNOS的mRNA表达水平分别降低62.25%和57.86%。LPS和罗格列酮处理A549细胞后细胞中NOX4和iNOS的蛋白表达水平也呈现相似的结果。并且,与对照组相比,采用10 ug/ml LPS处理A549细胞48小时,能够分别降低PPARy和Bcl-2的蛋白表达水平44.63%、52.23%,同时NF-κBp65和Bax的蛋白表达水平分别上升1.03和6.36倍。采用10ug/mlLPS和10umol/L罗格列酮处理A549细胞48小时,与单纯LPS处理组相比,A549细胞PPAy以及Bcl-2的蛋白表达水平分别显著上升2.21和0.46倍,而NF-κBp65和Bax的蛋白表达水平分别降低29.63%和51.43%,差异均具有统计学意义(p0.01)。结论:LPS能够抑制肺上皮细胞系A549细胞增殖、促进细胞凋亡、降低活性氧ROS水平以及包括TNF-α,IL-6和MCP-1在内的炎症细胞因子的产生。罗格列酮能够明显促进LPS刺激的A549细胞的增殖、降低细胞凋亡级细胞内活性氧ROS水平以及炎症反应。罗格列酮能够抑制NF-κB信号通路的激活,降低Bax/Bcl-2的表达比例。罗格列酮能够通过促进肺上皮细胞系A549细胞PPARγ的表达以减弱LPS诱导的细胞凋亡以及炎症反应,抑制NF-κB信号通路的激活。罗格列酮可作为治疗急性肺损伤的潜在治疗药物。第二部分罗格列酮对脂多糖诱导的内皮细胞的作用研究目的:罗格列酮是一种过氧物酶体激活受体γ(PPARγ)激动剂,本研究旨在探究罗格列酮是否能够抑制LPS诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞凋亡和炎症反应。方法:本研究分对照组、LPS组和LPS+罗格列酮干预组。采用1Oumo1/L的罗格列酮处理脂多糖(LPS)刺激的HUVECs,通过MTT法试验检测比较LPS以及罗格列酮干预不同时间段对HUVECs活力的影响;通过流式细胞术检测比较LPS和罗格列酮处理对HUVECs凋亡以及ROS水平的影响;LPS以及罗格列酮处理后48小时促炎细胞因子TNF-α,IL-6,趋化因子CXCL12以及趋化因子受体CXCR4的水平分别通过ELISA、real-time PCR和western blot进行检测;通过real-time PCR和western blot检测LPS以及罗格列酮处理后48小时PPARγ,JAK2/STAT3、Bax、Bcl-2、NOX4 和 iNOS 的 mRNA 水平以及蛋白水平。结果:(1)采用10ug/ml LPS处理HUVECs细胞24、48和72小时能够分别抑制细胞活力15.7%、31.2%和49.3%。采用1Oug/ml LPS和10umol/L罗格列酮处理HUVECs24、48和72小时能够分别增加HUVECs的活力4.7%(p0.05)、22.7%(p0.01)和 44.1%(p0.01),差异具有统计学意义;(2)采用 1Oug/mlLPS处理HUVECs48小时能够显著增加HUVECs的细胞凋亡率7.4倍,而10umol/L罗格列酮处理能够减少62.2%的LPS引起的细胞凋亡。采用1Oug/ml LPS处理HUVECs48小时能够增加HUVECs的ROS水平3.5倍;同时用10umol/L罗格列酮处理能够抑制LPS引起的ROS水平45.9%,差异具有统计学意义(p0.01);(3)TNF-α,IL-6,CXCL12 以及 CXCR4 的水平在 LPS 处理的 HUVECs 中分别上调2.5、1.9、1.5以及1.8倍。而10umol/L罗格列酮处理能够减少LPS干预的 HUVECs 上清液中的 TNF-α,IL-6,CXCL12 以及 CXCR4 的水平 34.9%、27.0%、40.1%和41.6%,差异具有统计学意义(p0.01);(4)采用10ug/ml LPS处理HUVECs细胞48小时能够增加p-JAK2和p-STAT3的水平4.9和2.8倍。而10umol/L罗格列酮处干预后能够分别减少LPS处理的HUVECs中p-JAK2和p-STAT3的水平34.2%和38.9%,差异具有统计学意义(p0.01);(5)采用10ug/ml LPS处理HUVECs48小时能够显著减低PPARy和Bcl-2的水平43.8%和55.1%,增加Bax水平4.3倍。而10umol/L罗格列酮处理能够分别增加PPARy和Bcl-2的水平1.4及0.45倍,降低Bax的水平40.4%,差异具有统计学意义(p0.01)。结论:罗格列酮能够显著抑制LPS诱导的人HUVECs的活力下降、细胞凋亡、活性氧ROS水平以及炎症反应。LPS能够明显增加HUVECs中JAK2/STAT3信号通路的活性以及Bax/Bcl-2的比例,而罗格列酮处理能够使其明显降低。在体外,PPARy参与急性肺损伤的病理过程。进一步探究急性呼吸窘迫综合征的分子机制对于未来开发新型ALI/ARDS的治疗药物至关重要。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563
【图文】：

罗格列酮,细胞,细胞的,活力

３．１罗格列酮对ＬＰＳ处理的人肺泡上皮Ａ５４９细胞活力的影响逡逑与对照组相比，采用１０邋Ｈｇ／ｍｌＬＰＳ分别处理的人肺泡上皮Ａ５４９细胞２４、４８、逡逑７２小时后，Ａ５４９细胞的增殖活力分别下降１２＿０３％、２８．８３％以及４１．５０％邋（图１）。逡逑而采用１０邋ｐｇ／ｍｌＬＰＳ以及１０邋ｐｍｏｌ／Ｌ罗格列酮分别处理２４、４８、７２小时后，与逡逑单纯ＬＰＳ处理组相比，Ａ５４９细胞的增殖活力分别上升５．３９％、１７．２７％以及２４．３９％。逡逑我们懫用１０邋＾ｇ／ｍｌＬＰＳ以及１０叫ｏｌ／Ｌ罗格列酮处理４８小时进行后续试验。逡逑２９逡逑

罗格列酮,细胞凋亡,细胞的,细胞

３．２罗格列酮对ＬＰＳ处理的人肺泡上皮Ａ５４９细胞凋亡的影响逡逑与对照组相比，１０邋＾ｇ／ｍｌＬＰＳ处理４８小时能够显著诱导Ａ５４９细胞的细胞凋逡逑亡，其凋亡细胞比例是对照组的７．２倍（图２Ａ，图２Ｂ）。而采用１０ｐｇ／ｍｌＬＰＳ逡逑以及１０邋｜ｉＭ罗格列酮处理４８小时后，与单纯ＬＰＳ处理组相比，Ａ５４９细胞的细逡逑胞凋亡显著下降５８．２２％。逡逑３０逡逑

罗格列酮,细胞活性,脂多糖,细胞

３．３罗格列酮对ＬＰＳ处理的人肺泡上皮Ａ５４９细胞活性氧ＲＯＳ水平的影响逡逑与对照组相比，１０邋ｐｇ／ｍｌ脂多糖ＬＰＳ处理４８小时能够显著诱导Ａ５４９细胞逡逑细胞内活性氧ＲＯＳ的水平，其ＲＯＳ水平是对照组的１．７３倍（图３）。而懫用逡逑１０邋ｐｇ／ｍｌ脂多糖ＬＰＳ以及１０邋ｐｍｏｌ／Ｌ罗格列酮处理４８小时后，与单纯ＬＰＳ处理逡逑组相比，Ａ５４９细胞的细胞ＲＯＳ显著下降４５．６３％。逡逑３１逡逑

【参考文献】