GATA3-NFAT1相互作用在人T细胞IL-13基因表达中作用的研究

发布时间：2020-07-22 01:35

【摘要】： 支气管哮喘是一种严重危害人类健康的常见病,多发病。目前认为,支气管哮喘是以气道可逆性阻塞、高反应性和气道炎症为特征的一组综合征,气道炎症是前两者的基础。在多种遗传和环境因素共同作用下,经过巨噬细胞(包括树突状细胞)的抗原呈递作用,Na(?)ve T辅助细胞(Th 0)被活化,分化为Th 2细胞,释放IL-4、IL-5、IL-13等多种Th 2细胞因子,促进了支气管哮喘的形成和发展。其中IL-13是一种重要的Th2细胞因子,它通过诱导哮喘气道炎症、增加气道高反应性、促进粘液分泌,并参与了哮喘气道重建,成为支气管哮喘发病机制中的重要介质。但迄今为止,对IL-13基因表达的分子调控机制仍知之甚少。 T细胞是产生IL-13的主要来源。CD3/CD28双信号通路对T细胞的刺激能够模拟T细胞在体内受抗原活化产生Th2细胞因子的过程。转录因子在基因的表达和调控上具有核心作用,GATA3是Th2细胞特异性的转录因子,细胞中增高的GATA3能够同时促进Th2细胞中IL-4、IL-5和IL-13的基因表达。许多研究表明在IL-13基因启动子区域GATA位点对IL-13的基因表达起重要作用。活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)是TCR介导的信号转导通路中关键的转录因子。我们的前期研究表明在CD3/CD28双信号通路刺激后NFAT1与IL-13启动子结合增强。在人IL-13基因启动子区域GATA3与NFAT1位点邻近,作为同时参与IL-13基因转录的GATA3和NFAT1间是否存在相互作用?如何相互作用?均值得进一步探讨。本课题通过研究T细胞经CD3/CD28活化后观察GATA3和NFAT1在IL-13启动子区域功能上的相互作用,探索IL-13基因转录的分子机制,并进一步研究糖皮质激素丙酸氟替卡松(Fluticasonepropionate,FP)和传统哮喘治疗药物三氧化二砷(Arsenic Troxide,AT)对该相互作用的影响。第一部分GATA3-NFAT1相互作用在人活化T细胞IL-13基因表达中的作用目的:研究T细胞在CD3/CD28双信号通路共刺激活化后,细胞内GATA3与NFAT1的结合情况及NFAT1抑制剂FK-506对GATA3与IL-13启动子结合的影响,探讨GATA3-NFAT1相互作用在T细胞IL-13基因表达中的作用。方法:采用CD3/CD28单克隆抗体(浓度分别为10μg/ml和5μg/ml)双信号通路对Hut-78细胞进行共刺激,分别在0min、30min、1h、2h时采用免疫共沉淀(IP)的方法观察GATA3与N-FAT1结合情况及FK-506对两者结合的影响。通过染色质免疫共沉淀(CHIP)的方法研究NFAT1被FK-506阻断后GATA3与IL-13启动子区域的结合情况。结果:Hut-78细胞在CD3/CD28共刺激活化后,细胞内NFAT1和GATA3结合增强,在刺激30min时两者即有结合,随着刺激时间的延长在1h、2h时两者结合有进一步增强的趋势,呈明显的时间依赖性。FK-506(1n M)组在30min、1h、2h时均能抑制NFAT1与GATA3的结合,以2h时抑制更为明显(2.25±0.1 VS 1.18±0.09),P＜0.05。用FK-506对NFATl进行抑制后,GATA3与IL-13的启动子区域结合减弱。T细胞经CD3/CD28免疫共刺激活化30分钟时FK-506抑制GATA3与IL-13启动子结合的作用不明显,而在1h时能够抑制GATA3同IL-13启动子的结合(3.95±0.26 VS 2.82±0.44),2h时这种抑制效应更为明显,其抑制效应约为50%(4.34±1.42 VS 1.73±0.09),P＜0.05。结论:T细胞经过CD3/CD28共刺激活化后细胞内NFAT1和GATA3结合增强,FK-506能抑制两者的结合。FK-506能抑制GATA3与IL-13启动子区域结合。FK-506可能通过影响两者的结合,抑制了GATA3对IL-13基因转录的启动。第二部分:FP抑制活化T细胞IL-13基因表达的机制目的:研究T细胞在CD3/CD28共刺激活化后,FP对NFAT1和GATA3结合的影响及FP对GATA3与IL-13启动子结合的影响,探讨FP抑制活化T细胞中IL-13基因表达的可能机制。方法:采用CD3/CD28单克隆抗体(浓度分别为10μg/ml和5gg/ml)双信号通路对Hut-78细胞进行共刺激,分别在0min、30min、1h、2h时采用免疫共沉淀(IP)的方法观察GATA3与NFAT1结合情况及FP对两者结合的影响。通过染色质免疫共沉淀(CHIP)的方法研究FP对GATA3与IL-13启动子结合的影响。结果:与对照组相比,经CD3/CD28刺激组GATA3与NFAT1结合增强,且在30min、1h、2h各时间点逐渐增高,呈时间依赖性。FP(10~(-8)M)能够部分抑制GATA3与NFAT1的结合,在细胞活化30min(1.33±0.08VS 0.91±0.083)、1h(1.97±0.18 VS 1.56±0.13)、2h(2.65±0.18 VS 1.80±0.23)时FP均可抑制两者的结合(P＜0.05)。HUT-78细胞经CD3/CD28双信号通路共刺激活化后在30min、1h及2h各时间点GATA-3与IL-13启动子区域结合逐渐增强。FP在细胞活化1h能显著抑制GATA3与IL-13启动子区域结合(8.19±2.1 8 VS 2.69±1.33),P＜0.05。结论:T细胞经过CD3/CD28活化后GATA3与NFAT1结合增强,并促进GATA3与IL-13启动子区域结合。FP可能部分通过影响GATA3和NFAT1的相互作用,抑制T细胞IL-13基因表达。第三部分:砷剂对活化T细胞IL-13基因表达的影响目的:研究T细胞在CD3/CD28双信号通路刺激后IL-13的基因表达以及三氧化二砷对该基因表达的影响,并探讨三氧化二砷(AT)抑制IL-13基因表达的可能机制。方法:采用CD3/CD28单克隆抗体(浓度分别为10μg/ml和5μg/ml)双信号通路对Hut-78细胞进行共刺激,在30min及19h时用RT-PCR方法观察IL-13mRNA表达及AT对IL-13mRNA表达的影响,并采用IP方法观察在细胞活化0min、30min、1h、2h时GATA3与NFAT1结合情况及AT对两者结合的影响。结果:CD3/CD28双信号通路共刺激后,Hut-78细胞的IL-13mRNA表达增加,在19h时砷剂(5μM)能够明显抑制该基因的表达(6.77±2.78 VS 2.24±0.57),P＜0.05。Hut-78细胞在经过CD3/CD28免疫活化30分钟后,GATA3和NFATl两者即有结合且在2小时内两者结合呈逐渐增强趋势,AT在2h时能够部分抑制两者的结合(2.47±1.83VS 1.41±1.11,P＜0.05。结论:对Th2细胞IL-13基因转录表达的抑制可能是AT平喘抗炎的机制之一,该过程可能是通过部分抑制GATA3和NFAT1两者相互作用实现的。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R562.25
【图文】：

动态相互作用,条带,双信号,活化T细胞

N碑订1和GATA3结合情况。与对照组相比，在刺激30min时两者即有结合，随着刺激时间的延长在lh，2h时两者结合有进一步增强的趋势，呈明显的时间依赖性。(图1)G川队3(inPut)NFATINR订l(inPut)臼臼梦勿娜铆呀一匆盯一一~黔魏艇…一督一畜一{CD3/CD28刺激 Omin30minlh图1:T细胞活化后，细胞中NFAI，1和GAI诱.3的动态相互作用(IP/wB条带)2.FK一506对活化T细胞中NFATI和GATA3结合的影响免疫共沉淀方法(IP)检测HUT-78在CD3/CD28双信号通路刺激后细胞内NFArl和GALA3结合及FK一506对两者结合的影响。与eD3/eD28双信号通路刺激组相比，FK一506(InM)组在3omin，lh，Zh时均能抑制N于，Al，l与GAI人3的结合

双信号,时均,灰度,比值

eD3/eD28双信号通路刺激组相比，FK一506(InM)组在3omin，lh，Zh时均能抑制N于，Al，l与GAI人3的结合，2h时抑制明显 (2.245士 0.093vs 1.181士0.091)，p<0.05。(图2，图3，表l)

实时荧光定量PCR,启动子区

制GATA3与工L一13启动子的结合，这种抑制作用在 1h(3.952士0.262 VS2.819士0.444)及Zh(4.338士 1.42VS1.725士0.093)明显，只 0.05。(图4，图5，图6，表2)108+0D2 1.oe+001 1.De+DOD 1.0十D01 1.0B-0021，00一003 1.0令004 1.D任D05 1.0卜006 3579111315171921232527293133353739 CyeleNumber图 4:FK·506干预后几一13启动子区域与GAI’A3结合片段的实时荧光定量PCR扩增曲线 D.35 D.30 0.25 0.20 0.15 D.10D一05D一00一 0.05TemP俘rature(C).图5:FK一506干预后IL一13启动子区域与GALA3结合片段的实时荧光定量PCR融解曲线

【参考文献】