过氧化物酶体增殖物激活受体γ在内毒素致急性肺损伤中的保护作用及机制

发布时间：2020-07-29 15:54

【摘要】： 第一部分PPAR-γ在内毒素致急性肺损伤肺组织的表达变化及其意义 目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)在内毒素致急性肺损伤(ALI)中的表达变化及其意义。方法采用静脉注射脂多糖(LPS)6mg／kg复制ALI模型。30只雄性Wistar大鼠，随机分为5组(n=6只)：对照组、LPS 2h组、LPS 4h组、LPS 6h组和LPS 8h组。在相应时间将动物处死，采集动脉血测定氧分压(PaO_2)；取肺组织标本光镜下观察病理学改变，测定湿／干重比(W／D)、髓过氧化物酶(MPO)活性和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量，检测核因子-κB(NF-κB)p65和PPAR-γ的表达。结果LPS刺激引起大鼠PaO_2逐渐降低，于注射LPS后8h降至最低值；肺组织病理学评分、W／D和MPO活性均呈时间依赖性地升高，在注射LPS后8h达峰值。LPS致伤还显著增加肺组织中TNF-α的含量和NF-κB p65的活化程度，二者总体变化趋势一致。RT-PCR结果显示，LPS对不同时间点肺组织PPAR-γ1或PPAR-γ2 mRNA的表达水平均无显著性影响。但PPAR-γ核蛋白含量在注射LPS后2h开始明显降低，并随时间延长进一步降低。免疫组织化学结果显示，LPS致伤大鼠肺泡上皮细胞和巨噬细胞中PPAR-γ蛋白表达减少。结论LPS所致肺组织中PPAR-γ蛋白表达降低可能与ALI发生、发展的病理机制有关。 第二部分罗格列酮对内毒素致急性肺损伤的保护作用及其机制 实验一、罗格列酮对内毒素致急性肺损伤保护作用的研究 目的探讨PPAR-γ激动剂罗格列酮(ROSI)对内毒素(LPS)致急性肺损伤(ALI)的保护作用。方法36只雄性Wistar大鼠，随机分为6组(n=6只)：对照组、单纯ROSI组、单纯GW9662组、LPS组、ROSI预处理组(ROSI-LPS组)和GW9662拮抗组(GW9662-ROSI-LPS组)。对照组、单纯ROSI组、单纯GW9662组分别静脉注射10％二甲基亚砜(DMSO)2ml／kg、ROSI或GW9662 0.3mg／kg，30min后静脉注射生理盐水2ml／kg；LPS组静脉注射DMSO 2ml／kg，30min后静脉注射LPS 6mg／kg；ROSI-LPS组静脉注射ROSI 0.3mg／kg，30min后静脉注射LPS 6mg／kg；GW9662-ROSI-LPS组处理同ROSI-LPS组，但在给予ROSI前20min静脉注射GW9662 0.3mg／kg。注射LPS后4h处死动物，光镜下观察肺组织病理学变化，测定肺组织湿／干重比(W／D)、髓过氧化物酶(MPO)活性、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量，检测肺组织诱导型NO合酶(iNOS)mRNA和蛋白的表达以及硝基酪氨酸的形成。结果与对照组比较，LPS组出现明显的肺组织病理学损伤，W／D、MPO活性、MDA和NO含量升高(P＜0.01)，肺组织iNOS mRNA和蛋白表达以及硝基酪氨酸形成增加。与LPS组比较，ROSI-LPS组肺损伤明显减轻，W／D、MPO活性、MDA和NO含量降低(P＜0.01)，肺组织iNOS表达和硝基酪氨酸形成减弱。特异性PPAR-γ拮抗剂GW9662能取消ROSI的作用。结论本研究首次证实ROSI对内毒素所致的ALI具有保护作用，其机制是通过激活PPAR-γ。 实验二、罗格列酮对内毒素致急性肺损伤炎症调控机制的研究 目的研究罗格列酮(ROSI)对内毒素(LPS)致急性肺损伤(ALI)大鼠肺脏炎症反应和核因子-κB(NF-κB)激活的影响。方法36只雄性Wistar大鼠，随机分为6组(n=6只)：对照组、单纯ROSI组、单纯GW9662组、LPS组、ROSI-LPS组和GW9662-ROSI-LPS组。对照组、单纯15d-PGJ_2组、单纯GW9662组分别静脉注射10％二甲基亚砜(DMSO)2ml／kg、ROSI或GW9662 0.3mg／kg，30min后静脉注射生理盐水2ml／kg；LPS组静脉注射10％DMSO 2ml／kg，30min后静脉注射LPS6mg／kg；ROSI-LPS组静脉注射ROSI 0.3mg／kg，30min后静脉注射LPS 6mg／kg；GW9662-ROSI-LPS组处理同ROSI-LPS组，但在给予ROSI前20min静脉注射GW9662 0.3mg／kg。注射LPS后4 h处死动物，测定肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子-1(CINC-1)浓度，免疫组织化学法检测肺组织细胞间粘附分子-1(ICAM-1)蛋白的表达，Western blot分析肺组织NF-κB p65和PPAR-γ核蛋白的表达。结果ROSI预处理能显著减轻LPS诱导肺组织TNF-α和CINC-1的生成以及ICAM-1的表达。特异性PPAR-γ拮抗剂GW9662能消除ROSI的作用。另外，ROSI也能抑制肺组织NF-κB活化，并且上调PPAR-γ的蛋白表达。结论ROSI可减轻内毒素所致肺脏急性炎症反应，其作用机制可能通过抑制NF-κB活化和上调肺组织PPAR-γ的表达。 第三部分5-脱氧-Δ~(12，14)-前列腺素J_2对内毒素致急性肺损伤的保护作用及其机制 实验一、15-脱氧-Δ~(12，14)-前列腺素J_2对内毒素致急性肺损伤保护作用的研究 目的探讨PPAR-γ激动剂15-脱氧-Δ~(12，14)-前列腺素J_2(15d-PGJ_2)对内毒素(LPS)致急性肺损伤(ALI)的保护作用。方法36只雄性Wistar大鼠，随机分为6组，每组6只：对照组、单纯15d-PGJ_2组、单纯GW9662组分别静脉注射10％二甲基亚砜(DMSO)2ml／kg、15d-PGJ_2或GW9662 0.3mg／kg，30min后静脉注射生理盐水2ml／kg；LPS组静脉注射10％DMSO 2ml／kg，30min后静脉注射LPS 6mg／kg；LPS+15d-PGJ_2组静脉注射15d-PGJ_2 0.3mg／kg，30min后静脉注射LPS 6mg／kg；LPS+15d-PGJ_2+GW9662组处理同LPS+15d-PGJ_2组，但在给予15d-PGJ_2前20min静脉注射GW9662 0.3mg／kg。注射LPS后4h处死动物，光镜下观察肺组织病理学变化，测定肺组织湿／干重比(W／D)、髓过氧化物酶(MPO)活性、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量，检测肺组织诱导型NO合酶(iNOS)mRNA和蛋白的表达以及硝基酪氨酸的形成。结果与LPS组比较，LPS+15d-PGJ_2组肺损伤明显减轻，W／D、MPO活性、MDA和NO含量降低(P＜0.01)，肺组织iNOS mRNA和蛋白表达以及硝基酪氨酸形成均减弱。PPAR-γ拮抗剂GW9662能部分逆转15d-PGJ_2的作用。结论15d-PGJ_2对LPS所致的ALI具有保护作用，其机制至少部分是通过激活PPAR-γ。 实验二、15-脱氧-Δ~(12，14)-前列腺素J_2对内毒素致急性肺损伤炎症调控机制的研究 目的研究15-脱氧-Δ~(12，14)-前列腺素J_2(15d-PGJ_2)对内毒素(LPS)致急性肺损伤(ALI)大鼠肺脏炎症反应的影响及其机制。方法36只雄性Wistar大鼠，随机分为6组，每组6只：对照组、单纯15d-PGJ_2组、单纯GW9662(GW)组分别静脉注射10％二甲基亚砜(DMSO)2ml／kg、15d-PGJ_2或GW9662 0.3mg／kg，30min后静脉注射生理盐水2ml／kg；LPS组静脉注射10％DMSO 2ml／kg，30min后静脉注射LPS6mg／kg；LPS+15d-PGJ_2组静脉注射15d-PGJ_2 0.3mg／kg，30min后静脉注射LPS 6mg／kg；LPS+15d-PGJ_2+GW组处理同LPS+15d-PGJ_2组，但在给予15d-PGJ_2前20min静脉注射GW9662 0.3mg／kg。注射LPS后4h处死动物，测定肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子-1(CINC-1)的浓度，免疫组化法检测肺组织细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达，Western blot分析肺组织中核因子-κB(NF-κB)、PPAR-γ和血红素氧合酶(HO-1)的表达。结果15d-PGJ_2预处理能显著减轻LPS诱导肺组织TNF-α和CINC-1的生成以及ICAM-1的表达。特异性PPAR-γ拮抗剂GW9662能部分逆转15d-PGJ_2的上述作用。另外，15d-PGJ_2还能抑制肺组织NF-κB活化，并上调PPAR-γ和HO-1的蛋白表达。结论15d-PGJ_2可减轻内毒素所致的肺脏急性炎症反应，其机制可能是通过激活PPAR-γ、抑制NF-κB活化和上调肺组织HO-1的表达。 第四部分PPAR-γ激动剂对脂多糖刺激的大鼠肺泡巨噬细胞中NO生成和核因子-κB活化的影响 目的研究罗格列酮(ROSI)和15-脱氧-Δ~(12，14)-前列腺素J_2(15d-PGJ_2)对脂多糖(LPS)刺激大鼠肺泡巨噬细胞(AM)中一氧化氮(NO)生成和核因子-κB(NF-κB)活化的影响。方法分离大鼠AM，随机分组：①对照组；②单纯LPS组；③ROSI+LPS组：分别用终浓度为0.5、1、5或10μM的ROSI预处理30min，再以LPS(10μg／ml)刺激24h；④15d-PGJ_2+LPS组：分别用终浓度为0.5、1、5或10μM的15d-PGJ_2预处理30min，再以LPS(10μg／ml)刺激24h。收集细胞培养上清液，测定NO的含量。在另外的平行实验中，将AM随机分为：对照组、单纯LPS组、ROSI+LPS组和15d-PGJ_2+LPS组，分别用DMSO、10μM ROSI或15d-PGJ_2孵育30min，再以10μg／ml LPS刺激AM 1h或24h。采用免疫细胞化学方法检测NF-κB活化，Western免疫印迹检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表达。结果LPS刺激AM导致NO生成增加、iNOS蛋白表达增强以及NF-κB活化。ROSI或15d-PGJ_2(0.5～10μM)均能以剂量依赖方式抑制LPS所致NO生成。10μM ROSI或15d-PGJ_2显著抑制iNOS蛋白的表达和NF-κB活性增强。结论ROSI和15d-PGJ_2均能抑制LPS刺激的大鼠AM产生NO以及iNOS的表达，其机制可能与抑制NF-κB活化有关。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R563.8
【图文】：

图1大鼠肺组织病理学变化(HE， X200)A:eontrol组 ;B:LPS4h组表1各组大鼠Pa02、肺损伤评分、In二6，x士:或中位数W瓜比和MPO活性的比较(最小值一最大值)]GrouPsPa02(KPa) Lunginjury NV/DratioSC0reC口ntrol12.16士0.47 1.0(0一2) 3.81士0，14 MPOaetivity(U/g) 1.77士0.2010.43士0.58** 5.0(4一7)** 4.13士0.22 3.94士0.33**hh24 LPSLPSLPsLPS

然后逐渐增加，直至 LPSsh组达峰值(表1)。一四、肺组织匀浆液中TNF一a含量如图2所示， LPSZh、 LPS4h和 LPS6h组肺组织匀浆液中TNF一a含量显著高于对照组(尸<0.01)，且 LPSZh达峰值 :LPSsh组与对照组的差异无统计学意义 (P>0.05)。五、肺组织NF一忍活化免疫印记结果显示:对照组大鼠肺组织核提取物中仅有微量的NF一沼p65。静脉注射LPS后，大鼠的肺组织核提取物中NF一忍p65表达显著增加，于Zh达峰值(尸<0.01)。见图3。六、肺组织PPAR一mRNA和蛋白的表达PcR结果显示正常大鼠肺组织PPAR一妞mRNA的表达较高，而PPAR一帷mRNA的表达相对较低。与对照组比较，LPS各时相组PPAR一Yl或PPAR一 YZInRNA的表达量无显著性变化(图4A)。 Westemblot分析显示，PPAR一Y核蛋白含量在注射LPs后Zh开始降低

免疫印记结果显示:对照组大鼠肺组织核提取物中仅有微量的NF一沼p65。静脉注射LPS后，大鼠的肺组织核提取物中NF一忍p65表达显著增加，于Zh达峰值(尸<0.01)。见图3。六、肺组织PPAR一mRNA和蛋白的表达PcR结果显示正常大鼠肺组织PPAR一妞mRNA的表达较高，而PPAR一帷mRNA的表达相对较低。与对照组比较，LPS各时相组PPAR一Yl或PPAR一 YZInRNA的表达量无显著性变化(图4A)。 Westemblot分析显示，PPAR一Y核蛋白含量在注射LPs后Zh开始降低，并且进行性降低至 LPSsh(图4，B和C)。免疫组化结果显示，对照组大鼠的肺组织可见一定数量的PPAR一沙日性细胞，以核着色为主，胞浆仅见少量黄染，分布于肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞和小血管内皮细胞。LPS致伤大鼠肺泡上皮细胞和巨噬细胞的PPAR一Y蛋白表达减少(图5

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本文编号：2774181