PACER调控PPARγ-miR-124轴在LPS致巨噬细胞炎症反应中的作用及机制研究

发布时间：2020-08-23 14:21

【摘要】：研究背景:急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)因其高发病率和死亡率备受人们关注,严重威胁患者的生命健康。炎症失控是ALI/ARDS发生发展的中心环节,而巨噬细胞在其中发挥着关键的作用。因此,深入阐明巨噬细胞在ALI/ARDS发生发展中的炎症调控机制,可为ALI/ARDS的防治提供新思路、新见解。非编码RNA,包括长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA),微小RNA(microRNA,miRNA)等,在调控多种生理过程,包括细胞生存、分化、细胞周期和细胞迁移等过程中发挥重要作用。LncRNA是一类长度大于200个核苷酸、不编码蛋白质的一类RNA。最近研究发现LncRNA可作为炎症转录的增强子或抑制剂,其通过与染色质重塑复合物中的RNA结合蛋白相互作用作为支架分子起作用,并以基因特异性和时间依赖性方式调节炎性转录的动态和表观遗传控制。有研究报道P50相关的环加氧酶-2外源性RNA PACER(p50-associated COX-2 extragenic RNA,lncRNA PACER)是一种新的长链非编码RNA,已被发现可激活COX-2而密切参与炎症反应,但具体机制尚不清楚。miRNA是一类长度为18~25个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA。其通过抑制靶基因翻译或导致其降解,从而在转录后水平对基因的表达进行调控。研究表明,miR-124在调控炎症反应中发挥重要作用,其可通过抑制IL-6R、结合信号转导和转录激活因子3(STAT3)、NF-κB p65亚基和TNFR相关因子6(TNF receptorassociated factor6,TRAF6)来调节LPS诱导的细胞因子产生,以减少IL-6产生,以及降低TNF-α转化酶(TACE)使TNF-α释放减少。但miR-124在炎症反应中如何被调控尚不清楚,需进一步的研究。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferators activated receptorγ,PPARγ),作为一种转录因子,可参与调节葡萄糖代谢、脂质代谢、炎症和癌症的进展。相关研究报道被配体激活的PPARγ可通过抑制信号转导激酶或转录调节因子的活性以及相关信号通路,抑制促炎因子表达或升高抗炎因子,以及促进炎性细胞的凋亡等,进而发挥抗炎作用。因此,有学者认为PPARγ有可能成为抑制炎症反应的新治疗靶点。但目前PPARγ的如何被调控以及抗炎机制仍未完全阐明。因此,更深入地了解PPARγ的抗炎机制将有利于治疗一些炎症性疾病。基于此,我们旨在探索PACER、PPARγ以及miRNA在炎症的发生发展过程中的作用以及可能存在相互调控作用,有望为ARDS提供新的治疗策略。目的:探索PACER在LPS诱导巨噬细胞炎症反应中的关键作用以及对PPARγ和miR-124调控的关键机制。研究方法:1.研究PACER在LPS致巨噬细胞炎症反应中的作用及机制1.1诱导巨噬细胞(Mφ):培养THP-1细胞,应用100μM佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)处理48h,使THP-1分化成为巨噬细胞(Mφ)。1.2 Mφ经LPS刺激,应用Real-time PCR分析其PACER,miR-124的表达变化。1.3 THP-1转染PACER siRNA后,用PMA诱导成为Mφ。应用Real-time PCR分析PACER、miR-124;应用Western blot检测PPARγ蛋白表达变化。Mφ经LPS刺激,应用Real-time PCR分析PACER、miR-124以及TNF-α,IL-6,IL-10的表达。2.PPARγ在LPS致ALI中的作用探究2.1经腹腔注射LPS建立小鼠肺损伤模型。经肺组织学检查(HE染色)观察小鼠肺损伤情况;通过Real-time PCR分析各组小鼠肺组织中TNF-α,IL-6的表达;通过流式多因子检测各组小鼠血清中TNF-α,IL-6的表达;经Western blot检测小鼠肺组织中PPARγ蛋白表达变化。2.2小鼠经PPARγ激动剂罗格列酮(Rosiglitazone,Rosi)预处理后,再复制ALI模型。经肺组织学检查(HE染色)观察各组小鼠肺损伤情况;通过Real-time PCR分析各组小鼠肺组织中TNF-α,IL-6的表达;通过流式多因子检测各组小鼠血清中TNF-α,IL-6的表达;Western blot检测各组PPARγ表达变化。3.PPARγ在LPS致巨噬细胞炎症反应中对miR-124调控作用及机制研究3.1 RAW264.7细胞分别经不同浓度的PPARγ激动剂环格列酮(Ciglitazone,Cig),吡格列酮(Pioglitazone,Pio)和曲格列酮(Troglitazone,Tro)或DMSO处理,应用Real-time PCR分析miR-124及其靶基因TRAF6表达变化。3.2 RAW264.7细胞用PPARγsiRNA或PPARγNC转染后分别经Cig、Pio、Tro处理,通过Real-time PCR分析miR-124及TRAF6的表达变化。3.3 RAW264.7细胞转染miR-124拮抗剂antagomir-124或NC后,再分别经Cig、Pio、Tro处理,经Real-time PCR分析TRAF6的表达变化。3.4 RAW264.7细胞用含有miR-124启动子的荧光素酶报告载体(luc-pGL3/miR-124)和空载体(luc-pGL3/Basic)转染,再分别经Cig、Pio、Tro处理,进行荧光素酶活性测定。3.5通过生物信息学进行分析预测miR-124启动子区中含有PPARγ的反应元件(PPARγresponse element,PPRE)。构建含miR-124启动子PPARγ结合位点野生型和突变的型荧光素酶报告载体(luc-pGL3/miR-124-WT/Mut),转染RAW264.7细胞,然后分别经Cig、Pio、Tro处理,进行荧光素酶活性测定。3.6 RAW264.7细胞分别经Cig、Pio、Tro处理,通过ChIP测定以检测PPARγ与miR-124的相互作用。3.7用miR-124拮抗剂antagomir-124或antagomir NC转染RAW264.7细胞后经Cig、Pio、Tro处理,再LPS或PBS刺激,收集细胞上清液,用ELISA检测TNF-α、IL-6表达水平。研究结果:1.Mφ细胞经LPS刺激后,PACER、TNF-α和IL-6 mRNA的表达水平显著高于对照组(P0.05),而miR-124以及IL-10 mRNA的表达水平显著降低(P0.05)。2.与NC相比,PACER siRNA组的Mφ细胞,PACER的表达水平显著降低,而miR-124 mRNA和PPARγ蛋白的表达水平显著升高(P0.05)。PACER siRNA组经LPS刺激后,TNF-α、IL-6 mRNA的表达量较NC组明显降低,而IL-10 mRNA表达则增加(P0.05)。3.与正常对照组相比,ALI模型组小鼠的肺组织中出现明显充血、肺泡萎陷和肺泡壁增厚,并且肺组织及血清中炎症因子TNF-α,IL-6表达水平均显著升高(P0.05)。此外,模型组肺组织中PPARγ蛋白表达水平比对照组明显降低(P0.05)。4.罗格列酮预处理小鼠可以减轻LPS诱导的小鼠肺组织损伤:经Rosi预处理的小鼠(LPS+Rosi组)肺组织损伤较LPS组减轻;与LPS组相比,LPS+Rosi组小鼠肺组织及血清中炎症因子TNF-α,IL-6 mRNA相对表达量相比均明显降低(P0.05)。5不同PPARγ激动剂(Cig,Pio,Tro)均可上调miR-124的表达,呈浓度依赖;同时下调miR-124靶基因TRAF6 mRNA的表达水平(P0.05)。6.与对照组相比,RAW264.7细胞转染PPARγsiRNA后分别给予Cig,Pio,Tro处理,miR-124相对表达量明显降低,而TRAF6 mRNA表达则明显上调(P0.05);且RAW264.7细胞转染antagomir-124后分别经Cig,Pio,Tro处理,TRAF6 mRNA的相对表达量明显升高(P0.05)。7.荧光素酶报告基因检测显示经Cig,Pio,Tro处理,细胞中luc-pGL3/miR-124的荧光素酶活性显著增加。细胞分别通过Cig,Pio,Tro处理后,luc-pGL3/miR-124-Mut组的荧光素酶活性显著低于luc-pGL3/miR-124-WT组(P0.05)。ChIP测定显示PPARγ可以直接结合miR-124启动子中的PPRE。8.RAW264.7细胞转染antagomir-124后通过PPARγ不同激动剂(Cig,Pio,Tro)处理,再经LPS刺激,细胞炎症因子TNF-α、IL-6水平明显升高(P0.05)。而转染antagomir NC后,通过Cig,Pio,Tro处理,再经LPS刺激的RAW264.7细胞中,炎症因子TNF-α、IL-6水平明显降低(P0.05)。结论:1.PACER是调控LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的关键分子,其可能是通过调控PPARγ以及miR-124进而发挥调控炎症反应的作用;2.PPARγ通过直接结合miR-124启动子区域中的PPRE,增强miR-124启动子转录活性,上调其表达,进而抑制炎症因子的生成和释放,发挥抗炎作用。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563.8
【图文】：

qPC照 处-12CR 分析 LP组未受到 L处理后，细胞24 mRNA 表PS 对细胞炎LPS 刺激处胞中的 PAC表达降低（陆军军医炎症因子、处理的细胞CER、TNFP＜0.05）。医大学硕士学PACER、胞（即 DMSF-α、IL-6。学位论文miR-124 的SO 组）相比mRNA 的表的表达影响比，Mφ 细表达水平明响。实验结果胞通过 1μg明显增加，果表g/mIL

诱导为M

2成ea测.2.02.2.2 PACER成为 Mφ 细胞al-time PCR测炎症因子表2.3 WB 检测过 PACER胞蛋白，使NC 组）相05）。R 对炎症因子胞后经 Real-检测 miR-1表达情况。*测敲低 PACsiRNA 转染使用 WB 检相比，敲低子及 miR-124-time PCR 检24 的表达变P＜0.05 与对CER 后，M染 THP-1 细检测分析 PP低 PACER 后4 表达的影响检测 PACER变化。（C）Mφ对照组相比。φ 细胞中细胞 48h 后PARγ 蛋白表后，Mφ 细响。（A）PAC的表达。（B细胞经 LP。^P＜0.05PPARγ 蛋白后经 PMA（1表达变化。胞中的 PPACER siRNA 转）Mφ 细胞S（1μg/mL）与 NC+LPS白表达变化100μM）诱导实验结果表ARγ 蛋白的转染 THP-1胞转染 PACE处理 24h，组相比。化导成为 Mφ表明，与对的表达量明对明

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本文编号：2801631