ARDS患者循环中性粒细胞和脂多糖诱导人肺微血管内皮细胞表达谱分析

发布时间：2020-08-31 10:24

　　 1.研究背景急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的特征是肺泡-毛细血管屏障的弥漫性损伤、免疫细胞浸润、富含蛋白质的肺泡水肿液和严重的气体交换异常。尽管经过了50多年临床和基础的研究,ARDS仍然是一个严峻的挑战。ARDS不仅增加医疗成本并严重影响患者生活质量,而且死亡率很高。因此,迫切需要深入了解ARDS的发病机制。中性粒细胞(PMNs)作为先天免疫细胞对控制感染起到至关重要的作用。在ARDS发病过程中,循环PMNs被激活并穿透肺泡-毛细血管屏障进入肺泡。PMNs在肺泡炎性微环境中进一步活化,发挥吞噬病原体、释放活性氧和中性粒细胞胞外陷阱的重要作用。活化的中性粒细胞进一步导致肺泡损伤和肺功能的丧失。然而,ARDS循环PMNs活化的机制仍然知之甚少。近十年来,高通量检测技术的快速发展为ARDS转录组学的研究提供了技术支持。然而,既往高通量研究存在一个问题:检测样本是全血或总白细胞而不是纯化的中性粒细胞。本研究中,为了鉴定ARDS特异性中性粒细胞表型,我们分析了GSE76293数据集ARDS患者循环PMNs和GSE4975数据集暴露于严重脓毒症患者血浆的PMNs的差异表达基因(DEGs)。利用生物信息学方法,我们鉴定了ARDS特异性循环中性粒细胞表型的关键通路和基因。2.研究目的本研究的目的是鉴定ARDS特异性循环中性粒细胞表型的关键通路和基因,为ARDS的诊断和治疗提供新的思路。3.研究方法3.1芯片数据我们在GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中检索ARDS和脓毒症血液PMN的表达谱,最终筛选得到数据集GSE76293和GSE49757。我们选择GSE76293数据集12例ARDS患者循环PMNs样本与12例健康志愿者(HVT)循环PMNs样本;同时选择GSE49757数据集20例严重脓毒症血浆刺激的PMN样本与19例HVT血浆刺激的PMN样本用于差异分析。3.2差异表达基因的鉴定使用GE02R软件分析GSE76293和GSE49757中实验组与对照组的差异表达基因(DEGs),其中筛选标准是adj p0.01和|log2差异倍数|1。使用维恩图软件分析GSE49757和GSE76293 DEGs的交集。3.3基因本体论(GO)和信号通路富集分析利用DAVID数据库分析DEGs的功能和通路富集情况。P0.05被认为具有统计学意义。3.4蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络和功能模块分析使用STRING数据库预测DEGs之间的相互作用,然后使用Cytoscape软件绘制PPI网络。使用Cytoscape软件CytoNCA和MCODE插件鉴定PPI网络的功能模块和核心(hub)基因。3.5转录因子(TF)调控网络分析使用Cytoscape的iRegulon插件预测PPI网络核心基因的TFs。阈值设定为标准化富集分数(NES)4。3.6核心基因mRNA相对表达水平的验证为了分析GSE49757和GSE76293中7个核心基因mRNA的相对表达水平,我们从GEO数据库下载两个数据集的原始数据,经过log2标准化处理后使用GraphPad Prism 7.04统计分析并绘制箱式图。3.7统计学分析所有统计学分析均使用GraphPad Prism 7.04(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)。两组数据比较采用非配对t检验。所有数据均以平均值± SEM表示,p0.05被认为有统计学差异。4.研究结果4.1差异表达基因的鉴定在GSE76293中,与HVT血液PMNs相比,总共有1120个DEGs在ARDS血液PMNs中显着差异表达。在GSE49757中,与未感染的对照相比,总共有971个DEGs在暴露于严重脓毒症患者血浆的PMNs中显著差异表达。GSE49757和GSE76293 DEGs存在220个重叠基因。4.2基因本体论(GO)和信号通路富集分析GSE76293中DEGs主要参与以下生物学过程:凋亡过程、对氧化应激的反应、对脂多糖的反应、对肿瘤坏死因子的反应和白三烯信号传导通路。GSE76293中DEGs主要富集在以下通路:MAPK信号通路、FoxO信号通路、AMPK信号通路和TNF信号通路。GSE49757中DEGs主要与以下生物学过程相关:炎症反应、对脂多糖的反应、细胞凋亡过程、免疫应答、细胞因子产生的正调节和NF-κB信号传导的正调节。GSE49757中DEGs主要富集在以下通路:NF-κ B信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD样受体信号通路和TNF信号通路。4.3蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络使用Cytoscape软件构建了具有899个节点的PPI网络,并利用MCODE和CytoNCA插件分析PPI网络中的功能模块和核心基因。最终我们鉴定了30个核心基因和3个最重要的功能模块。其中,GAPDH、AKT1、MAPK14、MAPK8、IL8、PIK3CB和MMP9是三个功能模块的核心基因。4.4转录因子(TF)调控网络分析使用Cytoscape软件iRegulon插件预测了PPI网络中前50个核心基因的TFs。当设定阈值NES4时,筛选到6个转录因子(E2F1、NFKB1、NFYA、PBX3、EGR1、RELA)及其30个靶向基因。4.5核心基因mRNA相对表达水平的验证本研究比较了 GSE49757和GSE76293中7个核心基因的相对mRNA表达水平。结果发现在GSE49757和GSE76293中,AKT1和IL8均被下调,MAPK14均被上调;而GAPDH、MAPK8、PIK3CB和MMP9相对表达趋势不同。5.结论我们鉴定了参与ARDS特异性中性粒细胞表型的关键通路和基因。MAPK8、PIK3CB和MMP9可能在ARDS特异性循环中性粒细胞活化中起关键作用。这些发现可能为急性呼吸窘迫综合征的诊断和治疗提供新的视角。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R563.8
【部分图文】：

图１－１邋ＧＳＥ４９７５７和ＧＳＥ７６２９３差异表达基因聚类图、火山图和维恩图。Ａ：逡逑ＧＳＥ７６２９３基因表达谱聚类图，红色到蓝色代表从高到低的ｍＲＮＡ表达水平。Ｂ：逡逑ＧＳＥ７６２９３差异表达基因火山图，灰点表示没有变化，蓝点和红点分别表示下调逡逑和上调基因。Ｃ：维恩图显示ＧＳＥ４９７５７和ＧＳＥ７６２９３之间ＤＥＧｓ交集。逡逑

图１－３邋ＧＳＥ７６２９３中基于８９９?

图１－４邋ＧＳＥ７６２９３邋ＰＰＩ网络最重要的３个功能模块

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本文编号：2808673