PI3K-Akt-mTOR通路介导LPS抑制肺成纤维细胞自噬的实验研究

发布时间：2020-08-31 15:53

　　 革兰氏阴性杆菌细胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是内毒素的主要成份,也是引起急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)和肺纤维化的重要致病因素。LPS能诱导肺成纤维细胞异常增殖活化并分泌胶原蛋白沉积于肺组织,引起肺纤维化,但相关机制尚未完全阐明。近年来研究提示肺成纤维细胞自噬抑制过程与肺纤维化进程密切相关,但目前尚未明确在LPS诱导的肺纤维化过程中是否存在肺成纤维细胞自噬抑制过程,对其相关调控机制也尚未明了。本课题组前期研究发现LPS可活化肺成纤维细胞PI3K-Akt通路引起细胞增殖,而近年来研究发现PI3K-Akt-m TOR通路是调控细胞自噬过程的重要途径,本课题组由此推测LPS可能通过活化PI3K-Aktm TOR信号通路抑制肺成纤维细胞自噬过程,而肺成纤维细胞自噬抑制可能与LPS诱导的肺纤维化过程密相关。目的本研究利用LPS抑制肺成纤维细胞自噬模型,深入研究LPS抑制肺成纤维细胞自噬现象及其内在机制,明确PI3K-Akt-m TOR信号通路在此过程中的作用,为进一步丰富和完善LPS致肺纤维化的发病机理、探索该病的防治手段奠定基础。方法体外培养小鼠原代肺成纤维细胞,通过Western Blot和免疫荧光技术检测LPS刺激后肺成纤维细胞内自噬相关蛋白LC3、Beclin1、SQSTM1/p62蛋白的表达,明确LPS对小鼠肺成纤维细胞自噬的影响;继而以Western Blot技术检测LPS刺激后PI3K-Akt-m TOR通路蛋白Akt和m TOR的活化情况,并分别以m TOR信号分子抑制剂雷帕霉素和PI3K-Akt通路抑制剂Ly294002预处理后,以Western Blot、免疫荧光技术和透射电子显微镜技术检测LPS刺激后肺成纤维细胞内PI3K-Akt-m TOR通路相关蛋白Akt和m TOR的活化情况、自噬相关蛋白LC3和SQSTM1/p62的表达以及自噬小体的形成情况,以明确PI3K-Aktm TOR通路在LPS抑制小鼠肺成纤维细胞自噬过程中的作用。结果1.以LPS刺激小鼠肺成纤维细胞后可引起自噬相关蛋白Beclin1的表达和LC3-II/I的比值下降。2.以LPS刺激小鼠肺成纤维细胞后可上调与自噬水平呈负相关的SQSTM1/p62蛋白的表达量,并抑制细胞内自噬小体的形成,同时促进PI3KAkt-m TOR通路相关蛋白Akt和m TOR的磷酸化。而予m TOR信号分子抑制剂雷帕霉素预处理后,可抑制由LPS刺激引起的SQSTM1/p62蛋白表达增高过程并促进细胞内自噬小体的形成,逆转LPS诱导的细胞自噬抑制过程;予PI3KAkt通路抑制剂Ly294002预处理后,可抑制LPS刺激引起的m TOR蛋白磷酸化和SQSTM1/p62蛋白表达增高过程并促进细胞内自噬小体的形成,从而逆转LPS诱导的细胞自噬抑制过程。结论LPS能抑制肺成纤维细胞自噬,PI3K-Akt-m TOR通路活化可介导LPS引起的肺成纤维细胞自噬抑制过程。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R563
【部分图文】：

LPS刺激降低小鼠肺成纤维细胞Lc3一!1/1蛋白的比值

表 1 四组小鼠肺成纤维细胞 LC3-I、LC3-II 和 Beclin1 的蛋白表达灰（ x ±s）组别 样本例数 LC3-II/I BeclinCon. 3 1.96±0.26 0.71±LPS2503 1.75±0.15 0.65±LPS5003 1.54±0.21 0.66±LPS10003 1.22±0.23* 0.45±注：与 Con.组比较，*P<0.05。

LPS抑制小鼠肺成纤维细胞Lc3蛋白表达Fl公”re3LPSlnhilll抚dLC3exPressioninmouse】11们g右hroblasts注:以IO00ngll力L浓度的LPs刺激小鼠肺成纤维细胞30h后，以红色荧光Cy3对细胞内LC3蛋白进免疫荧光染?

【参考文献】

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本文编号：2809013