低氧对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度的影响及机制

发布时间：2020-08-31 21:21

　　 慢性低氧性肺动脉高压(CHPH)是大部分慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者最终发展成为肺心病而死亡的主要原因,关于其发病机制已经进行了大量的研究,临床以此为基础的治疗也取得了一定的疗效,然而,临床治疗CHPH的手段仍然有限,疗效依然欠佳。肺血管低氧早期(急性低氧)的收缩反应和慢性低氧性肺血管结构重建是CHPH发生的主要机制,造成CHPH的这两个主要环节不仅发生在肺动脉,而且包括肺静脉。尽管关于肺动脉急性低氧性收缩反应和慢性低氧性肺血管结构重建的机制已经进行了大量的研究,然而,关于肺静脉的此类研究却少有报道。大量的研究证明:细胞内Ca~(2+)在血管平滑肌细胞的收缩和增生的复杂机制中起至关重要的作用。但是,关于肺静脉平滑肌细胞(PVSMC)Ca~(2+)信号转导以及低氧对PVSMC细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)作用的研究却鲜有报道,我们推测:低氧可能通过某些机制使PVSMC的[Ca~(2+)]_i改变,参与CHPH的发生、发展过程。因此,我们建立了大鼠远端PVSMC原代培养模型及CHPH大鼠模型,对急慢性低氧诱导大鼠远端肺静脉平滑肌[Ca~(2+)]_i改变的作用及机理进行了研究。从以往研究甚少的肺静脉方面来阐述CHPH发生的可能机制,为寻找有效的防治肺动脉高压的方法打下坚实的理论基础。 方法 一、急性低氧对大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i的影响:首先利用胶原酶消化法分离、原代培养大鼠远端PVSMC,通过细胞形态学观察、平滑肌细胞α-actin免疫荧光和western-blot免疫印迹分析以及[Ca~(2+)]_i对高钾KRBS溶液的反应来鉴定PVSMC,从而建立大鼠远端PVSMC原代培养模型。然后利用InCyte细胞内钙浓度检测系统,观测急性低氧对大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i的影响 二、急性低氧对大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i影响的机制:1、利用InCyte细胞内钙浓度检测系统,观测电压依赖性钙通道(VDCC)拮抗剂硝苯地平对急性低氧诱导大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i改变的干预作用,明确是否有VDCC以外的钙通道参与急性低氧诱导的大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i改变过程。2、分离大鼠远端肺静脉平滑肌,原代培养大鼠远端PVSMC,通过荧光定量PCR和western-blot免疫印迹分析来检测经典瞬时受体电位(TRPC)蛋白在大鼠远端肺静脉平滑肌和培养的大鼠远端PVSMC的mRNA水平和蛋白水平的表达,明确大鼠远端肺静脉平滑肌是否表达TRPC蛋白。3、利用InCyte细胞内钙浓度检测系统,通过恢复细胞外钙法、锰荧光q 灭法,并利用储量操纵性钙通道(SOCC)拮抗剂SKF-96365和NiCl2,在大鼠远端PVSMC上检测Ca~(2+)通过由TRPC蛋白组成的SOCC而形成的储量操作性钙内流(SOCE),明确大鼠远端肺静脉平滑肌是否存在SOCE。4、利用InCyte细胞内钙浓度检测系统,通过恢复细胞外钙法、锰荧光q 灭法,并利用SOCC拮抗剂SKF-96365和NiCl2观测急性低氧对大鼠远端PVSMC的SOCE的影响,明确SOCE在急性低氧引起的大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i改变中的作用。 三、慢性低氧对大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i的影响:首先,通过慢性持续低氧(10%O2)条件下饲养大鼠3周建立CHPH大鼠模型;然后,分离正常大鼠和CHPH大鼠远端PVSMC;最后,利用InCyte细胞内钙浓度检测系统,分别检测正常大鼠和CHPH大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i,从而明确慢性低氧对大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i的影响。 四、慢性低氧对大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i的影响的机制:1、分离正常大鼠和CHPH大鼠远端肺静脉平滑肌,通过荧光定量PCR和Western-blot免疫印迹分析来检测TRPC在正常大鼠和CHPH大鼠远端肺静脉平滑肌的表达,明确慢性低氧对大鼠远端肺静脉平滑肌TRPC表达的影响。2、分离正常大鼠和CHPH大鼠远端PVSMC,利用InCyte细胞内钙浓度检测系统,首先分别检测由环匹阿尼酸(CPA)诱导的正常大鼠和CHPH大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i变化,然后分别检测由CPA诱导的正常大鼠和CHPH大鼠远端PVSMC的锰荧光q 灭,从而明确慢性低氧对大鼠远端肺静脉平滑肌SOCE的影响;接着分别检测由油酰基乙酰甘油(OAG)诱导的正常大鼠和CHPH大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i变化,最后分别检测由OAG诱导的正常大鼠和CHPH大鼠远端PVSMC的锰荧光q 灭,从而明确慢性低氧对大鼠远端肺静脉平滑肌由受体操纵性钙通道(ROCC)介导的Ca~(2+)内流的影响。 结果 一、急性低氧对大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i的影响: 1、成功建立了大鼠远端PVSMC原代培养模型,原代培养的大鼠远端PVSMC不仅表现出典型的血管平滑肌细胞的形态学和免疫学特征,而且具有完好的生理学功能。 2、急性低氧使大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i升高。 二、急性低氧对大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i影响的机制: 1、作为VDCC拮抗剂,硝苯地平能完全阻断高钾KRBS溶液引起的大鼠远端PVSMC [Ca~(2+)]_i升高,却只能部分抑制急性低氧引起的大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i升高,提示VDCC以外的钙通道参与急性低氧引起的大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i升高。 2、在大鼠远端肺静脉平滑肌组织和培养的PVSMC都有TRPC的mRNA表达,其中以TRPC-1、TRPC-4和TRPC-6,尤其是TRPC-1和TRPC-6的mRNA表达最强。Western-blot免疫印迹分析进一步表明,在大鼠远端肺静脉平滑肌组织和培养的PVSMC都有TRPC蛋白的表达,且尤其以TRPC-1和TRPC-6的蛋白表达最强。 3、在去除细胞外Ca~(2+)、用硝苯地平阻断VDCC并用CPA使Ca~(2+)从PVSMC肌浆网完全清空的条件下,恢复PVSMC细胞外Ca~(2+)后, PVSMC [Ca~(2+)]_i可迅速显著升高;在去除细胞外Ca~(2+)并用硝苯地平阻断VDCC的条件下,CPA使Mn~(2+)引起的PVSMC的荧光q 灭增强;作为SOCC拮抗剂,SKF-96365和NiCl2均能明显抑制由CPA诱导的PVSMC [Ca~(2+)]_i升高和锰荧光q 灭增强,但对高钾KRBS溶液引起的PVSMC [Ca~(2+)]_i升高没有影响,提示大鼠远端PVSMC存在SOCE。 4、急性低氧能显著增加由CPA诱导的、恢复细胞外钙后所引起的大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i升高,并能增强由CPA诱导的大鼠远端PVSMC的锰荧光q 灭; SKF-96365和NiCl2均能明显抑制急性低氧引起的大鼠远端PVSMC的SOCE增加;在常氧情况下,用不含CPA但含有硝苯地平的无钙溶液孵育PVSMC,锰荧光q 灭与不加Mn~(2+)的细胞的荧光自发衰减量没有差异;而在急性低氧情况下,用不含CPA但含有硝苯地平的无钙溶液孵育PVSMC,锰荧光q 灭显著增加,而且此反应能被SKF-96365和NiCl2明显抑制,提示急性低氧自身能诱发大鼠远端PVSMC的SOCE,而且能够通放大SOCE,引起PVSMC [Ca~(2+)]_i升高。 三、慢性低氧对大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i的影响: 1、成功建立CHPH大鼠模型,慢性持续性低氧3周大鼠的MPAP、RVSP、RV/(LV+S)都明显增高,肺内血管壁明显增厚。 2、CHPH大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i较正常大鼠明显增高,提示慢性低氧使大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i升高。 四、慢性低氧对大鼠远端PVSMC[Ca~(2+)]_i影响的机制: 1、荧光定量PCR和western-blot免疫印迹分析证实:在CHPH大鼠远端肺静脉平滑肌组织TRPC-6蛋白的表达较正常大鼠明显增强,而TRPC-1和TRPC-4蛋白的表达较正常大鼠没有明显改变,提示慢性低氧上调大鼠远端肺静脉平滑肌组织TRPC-6蛋白的表达。 2、用硝苯地平阻断VDCC并恢复细胞外Ca~(2+)后,CPA不仅能导致CHPH大鼠远端PVSMC [Ca~(2+)]_i迅速升高,而且能使正常大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i也迅速升高,两者升高幅度无差别;用含CPA和硝苯地平的无钙溶液孵育细胞,CHPH大鼠远端PVSMC的锰荧光q 灭与正常大鼠的也无差别。然而,用硝苯地平阻断VDCC并恢复细胞外Ca~(2+)后,OAG能使正常大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i升高,而CHPH大鼠远端PVSMC由OAG诱导的[Ca~(2+)]_i升高较正常大鼠更明显;同时,OAG诱导的锰荧光q 灭在CHPH大鼠远端PVSMC也比正常大鼠表现的更强,提示慢性低氧通过增加由ROCC介导的Ca~(2+)内流使大鼠远端PVSMC的[Ca~(2+)]_i升高。 结论 1、急性和慢性低氧都能使大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度升高。 2、大鼠远端肺静脉平滑肌主要表达TRPC-1、TRPC-4和TRPC-6,尤以TRPC-1和TRPC-6为主;大鼠远端肺静脉平滑肌存在SOCE。 3、急性低氧不仅自身能够诱发大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的SOCE,而且能够放大SOCE,从而引起细胞内钙浓度升高。 4、慢性低氧能够上调大鼠远端肺静脉平滑肌TRPC-6的表达,使主要由TRPC-6蛋白组成的ROCC增加,导致由ROCC介导的Ca~(2+)内流增加,从而引起细胞内钙浓度升高。
【学位单位】：广州医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R543.2;R563.9
【部分图文】：

图 1-1： 倒置相差显微镜下观察培养的大鼠远端 PVSMC 100×A.大鼠远端 PVSMC 接种后 3 天内开始分裂生长，细胞呈长梭形，细胞中间凸起的部分含有细胞核。B.当细胞进一步生长达较密融合时，细胞呈簇状生长。C.细胞进一步融合，并行排列呈束生长。D.当细胞完全融合时，细胞表现出典型的血管平滑肌细胞生长的特点，即“峰谷”状生长。27

图 1-2： 大鼠远端 PVSMC α-actin 免疫荧光染色 400×A.大鼠远端 PVSMC α-actin 免疫荧光染色呈阳性反应，可见非常典型的、直的、无电缆样纤维沿细胞长轴并行排列。B.当 PVSMC 进一步融合，细胞质中填满强阳性反应的蛋白纤维。C.无一抗孵育的对照组 PVSMC，α-actin 免疫荧光染色呈阴性反应。D.PVSMC 对 Von Willebrand 因子免疫荧光染色呈阴性反应。E.HUVEC 对 Von Willebrand 因子免疫荧光染色呈阳性反应。F.无一抗孵育的 HUVEC 对 Von Willebrand 因子免疫荧光染色呈阴性反应。28

图 1-3： 大鼠远端 PVSMC α-actin 蛋白 Western 印迹结果 10 15 20 25controlKCLKCL+Nifed050100150200250ΔC[a+2]in(M)B＊

【引证文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 曹平安;血管内皮生长因子对血管内皮细胞镁离子浓度的影响[D];遵义医学院;2011年

本文编号：2809336