GSK3β、CLIP-170在小鼠气道上皮损伤与修复中的表达变化及其意义

发布时间：2020-09-17 11:20

　　急慢性支气管炎引起气道粘膜上皮细胞损伤,在其后的修复过程中,周围上皮细胞迁移、分裂增生和分化,以重新覆盖受损区域。细胞迁移时细胞形态改变、胞膜突起的定向及中心体的极化,分裂时染色体的捕获及纺锤体的形成和定向,这些细胞活动过程均有赖于微管、微丝、Rho GTP酶及微管相关蛋白之间复杂的相互作用。Rho GTP酶是Ras超家族中小分子量G蛋白的成员之一,是一组分子量约为20～25kd的鸟苷酸结合蛋白,在细胞的信号转导通路中作为信号转换器或分子开关,作用于细胞骨架或其靶蛋白而产生多种生物效应,包括Cdc42、RhoA、Rac等,其中以Cdc42研究最多。微管相关蛋白包括APC(adenomatous polyposis coli)、EB1(end-binding protein)、CLIP-170(cytoplasmic linker protein-170)和CLASP(CLIP-associated protein)等,它们结合在微管正极上,参与微管动力学和功能的调节。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)在细胞内呈组成性激活,APC和CLASP都是其底物。GSK3β活性改变及其对一些微管相关蛋白的磷酸化修饰,能够影响微管的动力学和功能,进而影响细胞的迁移、分裂等生命活动。目的研究GSK3β及CLIP-170在博莱霉素引起的小鼠气道上皮损伤和修复中的表达变化及其意义,以进一步阐明上皮损伤后修复的分子机制。方法健康昆明种小鼠(雌雄不拘)36只,腹腔注射麻醉后经气管插管一次性缓慢注入BLMA5 5mg/kg,诱导其气道上皮急性损伤。随后分批处死小鼠,获取肺组织和气管,以6只正常小鼠作为对照。用免疫组织化学S-P法检测GSK3β及CLIP-170蛋白在气道上皮细胞中的定位与表达;用western blot技术检测GSK3β、P-GSK3β、Cdc42及CLIP-170在损伤修复过程中表达的动态变化;并用免疫双标和共聚焦显微镜技术检测GSK3β及CLIP-170分别与微管蛋白β-tubulin的共定位关系。结果一、大体观察: 正常组小鼠双肺红润,表面光滑,弹性良好。实验组小鼠肺组织出现点状出血、肿胀,后期肺组织体积缩小、硬度增加等不同程度的病理变化。二、HE镜下观察: 光镜下正常气道上皮细胞排列整齐,为假复层纤毛柱状上皮或纤毛柱状上皮。实验组小鼠肺组织炎性细胞浸润,气道及肺泡上皮细胞坏死、脱落,纤毛倒伏,继而炎性细胞减少,上皮细胞修复,肺间质成纤维细胞增生,纤维化。三、免疫组化染色: GSK3β在正常对照组气道上皮细胞质内表达水平较高,BLM刺激后4d及7d时GSK3β表达迅速降低(P0.01),而在随后的14d及28d时又有所回升(P0.01),但仍低于对照组;CLIP-170在正常对照组细胞质内呈低表达,实验组则随着损伤的进行而表达逐渐升高,两组间差别具有显著性意义(P0.01)。四、western blot检测: GSK3β在实验组早期损伤阶段水平降低,修复末期回升(P0.01); P-GSK3β呈相反变化。Cdc42在实验组早期损伤阶段升高,随后渐呈下降趋势(P0.05);CLIP-170在实验组给予BLM后呈持续升高趋势,与对照组比较,P0.01。五、免疫荧光及共聚焦显微镜检测: β-tubulin在正常对照组小鼠气道上皮中分布较弥散,BLM刺激后4d、7dβ-tubulin明显沿气道上皮细胞近腔面和侧缘细胞膜下呈线状分布,肺泡上皮细胞质内也出现表达。CLIP-170及GSK3β的分布与β-tubulin比较一致,BLM14d、28d时,CLIP-170、GSK3β和β-tubulin均出现向胞质内侧转移、弥散分布的趋势。结论 1. GSK3β的磷酸化与Cdc42调节有关; 2. GSK3β和P-GSK3β在气道上皮损伤与修复过程中呈波动性变化并在形态学上与微管共定位,提示其可能参与调节微管相关蛋白在微管正极末端的聚集与结合; 3. CLIP-170在气道上皮损伤后表达增强且可能与微管蛋白结合,促使微管向细胞周边聚集。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2006
【中图分类】：R562.21
【部分图文】：

蛋白印迹法,小鼠,积分光密度

Westernblot蛋白印迹法检测小鼠肺组

蛋白印迹,β图

Westernblot蛋白印迹检测CLIP-170

侧缘,红色荧光,气道上皮细胞

图23图23BLM7d组CLIP-170激发红色荧光，向气道上皮细胞近腔面和侧缘聚集（CLSM×

【参考文献】