FLIP腺病毒表达载体的构建及其对Ⅱ型AEC、PVEC的抗凋亡作用的初步研究

发布时间：2020-10-10 08:27

　　 目的及意义:ALI/ARDS是战时及日常临床工作中常见的危重症之一。过去10-15年ALI/ARDS的病死率有所下降,但仍高达40 %。目前,对ALI/ARDS的发病机制尚未完全明确,临床上缺乏特效治疗方法,现仍以对症和支持治疗为主要手段。故研究新的治疗策略是临床学家所关注的热点问题。FLIP是一种细胞凋亡的抑制蛋白,它在结构和序列上与caspase-8具有同源性,但由于在caspase-8中起催化作用的两个氨基酸残基Cys、His分别被Tyr、Arg所替代,从而使FLIP丧失了蛋白水解酶活性。FLIP可以与caspase-8竞争性结合FADD,阻断DISC的组装,从而抑制细胞凋亡。近年来,普遍认为ALI/ARDS是严重创伤和脓毒症等引发的过度炎症反应。多形核白细胞(PMN)、AEC、PVEC等多种细胞及细胞因子、炎症介质参与了ALI/ARDS的发病过程。其中, AEC、PVEC凋亡引起的呼吸膜通透性增高,在ALI/ARDS的发病中起着关键作用。本实验根据Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cell,AEC)、肺血管内皮细胞(pulmonary vascular endothelial cell,PVEC)凋亡在ALI/ARDS发病中的重要地位,利用FLIP竞争性抑制caspase-8的特点,通过AdMax系统构建FLIP重组体腺病毒感染Ⅱ型AEC、PVEC,从而抑制其凋亡,阻断ALI/ARDS的发病进程,本实验研究将为下一步体内实验奠定理论基础。 方法 1.构建FLIP重组体腺病毒:根据Ⅱ型AEC、PVEC凋亡在ALI/ARDS发病中的重要地位,利用FLIP可竞争性抑制caspase-8,阻断DISC形成,进而抑制细胞凋亡的特点,通过含有大鼠FLIP全长基因的原始载体及AdMax腺病毒包装系统,构建FLIP重组体腺病毒Ad-FLIP,包装产生出病毒后,经EcoRI+NheI双酶切及PCR鉴定构建是否正确,后扩增病毒,测定病毒滴度; 2.培养并感染大鼠Ⅱ型AEC(购于ATCC):根据测定Ad-FLIP的MOI值感染大鼠Ⅱ型AEC,感染24 h后,通过RT-PCR及western blot方法检测感染组及各对照组Ⅱ型AEC中FLIP的mRNA及蛋白表达,比较有无差异;通过细胞毒性Fas单克隆抗体(CH-11)诱导感染组及对照组Ⅱ型AEC发生凋亡,通过流式细胞仪分析两组细胞间早中期凋亡率的差别,随后经western blot方法分析凋亡相关蛋白Bax的表达变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测并比较两组细胞活性,分光光度计法检测并比较两组细胞内caspase-3的活力; 3.培养并感染大鼠PVEC:采用大鼠经典原代培养方法培养大鼠PVEC,原代培养的大鼠PVEC经光镜观察及Ⅷ因子间接免疫荧光鉴定培养是否成功。根据测定Ad-FLIP的MOI值感染大鼠PVEC,感染24 h后,通过RT-PCR及western blot方法检测感染组及各对照组PVEC中FLIP的mRNA及蛋白表达,比较有无差异。随后,通过细胞毒性Fas单克隆抗体(CH-11)诱导感染组及对照组PVEC发生凋亡,通过流式细胞仪分析感染组及对照组间早中期凋亡率的差别。 结果 1.利用含有大鼠FLIP全长基因的原始载体及Ad-Max腺病毒包装系统,包装出含有大鼠FLIP基因的腺病毒Ad-FLIP,经EcoRI+NheI双酶切及PCR鉴定复合预期结果,构建正确;测定病毒滴度v.p./mL:2.3×10~(11) ,TCID50/ml:7.1×10~9; 2.重组腺病毒Ad-FLIP感染大鼠Ⅱ型AEC24h后,经RT-PCR及western blot方法检测感染细胞内FLIP的mRNA及蛋白表达明显增加。细胞毒性Fas单克隆抗体(CH-11)诱导感染组及对照组Ⅱ型AEC发生凋亡,通过流式细胞仪分析Ad-FLIP感染组细胞凋亡率明显低于对照组(p0.05)。同时MTT结果提示,CH-11对两组细胞的活力均有抑制作用,且呈浓度依赖性,但感染组细胞较对照组有明显的抵抗(p0.05)。CH-11提高两组细胞caspase-3的活力,但FLIP可抑制caspase-3的活化(p0.05)。Western blot结果显示,FLIP可以抑制凋亡相关蛋白Bax的表达; 3.重组腺病毒Ad-FLIP感染大鼠PVEC24h后,经RT-PCR及western blot方法检测感染细胞内FLIP的mRNA及蛋白表达明显增加。细胞毒性Fas单克隆抗体(CH-11)诱导感染组及对照组PVEC发生凋亡,通过流式细胞仪分析Ad-FLIP感染组细胞凋亡率明显低于对照组(p0.05)。 结论 采用含有大鼠FLIP基因的重组体腺病毒Ad-FLIP分别感染大鼠Ⅱ型AEC、PVEC,可以显著提高其对Fas单克隆抗体诱导凋亡的抗性。FLIP抑制凋亡可能通过抑制细胞内caspase-3的活性以及凋亡相关蛋白Bax的表达而实现。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R563.8
【部分图文】：

－1FLIP原始质粒PCR鉴定图

第四军医大学硕士学位论文图 1－1 FLIP 原始质粒 PCR 鉴定图2重组质粒pDC316-FLIP鉴定PCR 鉴定应能获得 1.4 kb 的条带，电泳图谱与预期相符(图 1－2)。

重组质粒 pDC316-FLIP 经 EcoRI+NheI 双酶切鉴EXU-F测序结果：TCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGACTGAGCACTGTGTCTGCTGAGGTCATTTGATGAGGATGAGAAGGAGATGATGCTTGAGAACCTGGCTCCACCCAACGTCAGTGAGAGAGGCCAGCTCTCCTTCGCTGCGGTGCGGCGGTTTGACCTGCTCAAGACAGCGGTGGAGGACCATCTGTGCAGAATAGGGTGCTGCTGATGGAGATTGGGGATCCTCCTTAATTTTCCTTACAAAGGATT

【参考文献】

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1 钱桂生;急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征研究现状与展望[J];解放军医学杂志;2003年02期

本文编号：2834967