α-ENaC对大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖和迁移的影响
发布时间：2021-11-26 16:48
背景上皮钠离子通道（epithelial sodium channel,ENaC）是具有阿米洛利敏感性、非电压门控离子通道退化蛋白家族中的一个成员,由α、β、γ和δ四种亚单位组成的异源多聚体蛋白,其主要生理功能是跨越紧密相连的上皮单向地转运Na+,调节水和离子的转运。Ⅱ型肺泡上皮细胞是成年肺的干细胞,在肺损伤修复中起着重要作用,α-ENaC广泛分布于Ⅱ型肺泡上皮细胞。研究表明,α-ENaC参与调节生物体的发育及疾病的发生,如细胞增殖、细胞分化以及肺水肿的发生等。但对α-ENaC在Ⅱ型肺泡上皮细胞的作用和功能及其分子机制仍不甚明了。目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合SSA-RPG阳性克隆筛选报告载体构建α-ENaC基因敲除的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞系（L2细胞系）,检测基因敲除后细胞增殖、迁移能力以及基因表达谱的变化,进而阐明α-ENaC在大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞系中的功能和作用。方法1.利用在线分析软件（http://benchling.com）,设计合成3组靶向敲除α-ENaC基因第一外显子的导向RNA,将3组片段分别克隆到CRISPR/Cas9表达载体骨架...
【文章来源】：新乡医学院河南省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
ENaC的定位和功能示意图[33]
9和RuvC两个功能域对DNA双链进行切割。CRISPR/Cas9基因编辑技术虽然大大提高了基因组编辑的效率，但是由于核酸酶工作效率的低下以及细胞自身修复能力的不足，导致大部分细胞在转染核酸酶质粒后，基因组DNA并未被切割[55]，或者靶位点发生了突变却没有可用于观察和筛选的表型，所以我们联合应用CRISPR/Cas9系统和SSA-RPG阳性细胞富集系统。SSA-RPG阳性细胞富集系统已广泛运用于人、猪、小鼠和鸡等多种细胞[56-60]，该系统与CRISPR/Cas9系统结合使用不仅能够通过流式细胞术对阳性细胞进行富集，还能够通过荧光显微镜观察CRISPR/Cas9系统的核酸酶切割活性，使CRISPR/Cas9系统的工作效率大大提升。图1-2CRISPR/cas9的切割域示意图[61]Fig.1-2SchematicdiagramofthecleavagedomainsinCRISPR/cas9system[61]综上所述，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合SSA-RPG阳性细胞筛选系统构建α-ENaC基因敲除的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞系，观察基因敲除后细胞增殖能力、迁移能力以及基因表达谱的变化，进而阐明α-ENaC在大鼠L2细胞系中的功能和作用。
11MCO175三洋二氧化碳培养箱（日本SANYON公司）HR40-ⅡA2生物安全柜（青岛海尔医用低温科技有限公司）F01410.45μmPVDF膜（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）1×71倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）SpectraMaxParadigm酶标仪（美谷分子仪器有限公司）AVW-220D电子天平（上海精密科学仪器公司）Centrifuge5417R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）DYY-2C型电泳仪（北京六一科学仪器厂）ABISteponePlus实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）Tanon4500全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）THZ-D台式恒温振荡器（太仓市实验设备厂）GeneGenius全自动凝胶成像系统（英国SYNGENE公司）2实验方法2.1载体构建2.1.1α-ENaC基因靶位点的选择从NCBI获取大鼠基因组α-ENaC基因的全长序列，利用在线分析软件（http://benchling.com）针对α-ENaC基因的第一外显子序列设计并筛选出3个得分较高的靶位点，如图2-1所示。3个靶位点序列分别为GCATGGGCTGAGGAGGACAAGGG；CAACAACACCACCATCCACGGGG和TGTCCTCCTCAGCCCATGCAAGG，靶位点全长共23bp，其中划线部分的20bp序列被称为sgRNA，剩余3bp序列被称为PAM（NGG）。图2-1α-ENaC基因靶位点的选择Fig.2-1Choiceofα-ENaCgenetargetsequence2.1.2α-ENaC/Cas9表达载体的构建本实验所用的Cas9表达载体骨架载体pll3.7-mU6-CMV-NLS-huCAS9-NLS来自西北农林科技大学基因组学实验室[62]，由mU6启动子、sgRNA、CMV启动子和人1.3主要仪器名称品牌
【参考文献】：
期刊论文
[1]急性呼吸窘迫综合征小鼠肺内源性干细胞表达水平的研究[J]. 刘姿,张文平. 中华细胞与干细胞杂志(电子版). 2019(04)
[2]骨髓间充质干细胞条件培养基对小鼠肺泡上皮细胞增殖的影响及机制[J]. 周祉妤,昌建鈞,候亚鹏,丁炎,聂宏光. 山东医药. 2018(20)
[3]肺泡Ⅱ型上皮细胞在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征中的研究进展[J]. 李百玲,柴家科,段红杰,马丽. 中华损伤与修复杂志(电子版). 2014(03)
[4]血清药理学研究车前子对成骨细胞功能的影响[J]. 陈珺,刘家剑,卢丽,杨国柱,陆幸妍,黄剑,李青南. 中药材. 2012(11)
[5]Ⅱ型肺泡上皮细胞与急性肺损伤的研究进展[J]. 李超然,王智刚,朱运奎. 中国医药科学. 2011(11)
[6]上皮细胞钠通道α亚基在大鼠和人睾丸、精子中的表达及其与精子活力的关系[J]. 孔祥斌,李红钢,熊承良. 中国计划生育学杂志. 2007(03)
硕士论文
[1]急性肺损伤后内源性肺干/祖细胞的动态变化及其修复作用[D]. 李海胜.第三军医大学 2013
本文编号：3520554
【文章来源】：新乡医学院河南省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
ENaC的定位和功能示意图[33]
9和RuvC两个功能域对DNA双链进行切割。CRISPR/Cas9基因编辑技术虽然大大提高了基因组编辑的效率，但是由于核酸酶工作效率的低下以及细胞自身修复能力的不足，导致大部分细胞在转染核酸酶质粒后，基因组DNA并未被切割[55]，或者靶位点发生了突变却没有可用于观察和筛选的表型，所以我们联合应用CRISPR/Cas9系统和SSA-RPG阳性细胞富集系统。SSA-RPG阳性细胞富集系统已广泛运用于人、猪、小鼠和鸡等多种细胞[56-60]，该系统与CRISPR/Cas9系统结合使用不仅能够通过流式细胞术对阳性细胞进行富集，还能够通过荧光显微镜观察CRISPR/Cas9系统的核酸酶切割活性，使CRISPR/Cas9系统的工作效率大大提升。图1-2CRISPR/cas9的切割域示意图[61]Fig.1-2SchematicdiagramofthecleavagedomainsinCRISPR/cas9system[61]综上所述，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合SSA-RPG阳性细胞筛选系统构建α-ENaC基因敲除的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞系，观察基因敲除后细胞增殖能力、迁移能力以及基因表达谱的变化，进而阐明α-ENaC在大鼠L2细胞系中的功能和作用。
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【参考文献】：
期刊论文
[1]急性呼吸窘迫综合征小鼠肺内源性干细胞表达水平的研究[J]. 刘姿,张文平. 中华细胞与干细胞杂志(电子版). 2019(04)
[2]骨髓间充质干细胞条件培养基对小鼠肺泡上皮细胞增殖的影响及机制[J]. 周祉妤,昌建鈞,候亚鹏,丁炎,聂宏光. 山东医药. 2018(20)
[3]肺泡Ⅱ型上皮细胞在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征中的研究进展[J]. 李百玲,柴家科,段红杰,马丽. 中华损伤与修复杂志(电子版). 2014(03)
[4]血清药理学研究车前子对成骨细胞功能的影响[J]. 陈珺,刘家剑,卢丽,杨国柱,陆幸妍,黄剑,李青南. 中药材. 2012(11)
[5]Ⅱ型肺泡上皮细胞与急性肺损伤的研究进展[J]. 李超然,王智刚,朱运奎. 中国医药科学. 2011(11)
[6]上皮细胞钠通道α亚基在大鼠和人睾丸、精子中的表达及其与精子活力的关系[J]. 孔祥斌,李红钢,熊承良. 中国计划生育学杂志. 2007(03)
硕士论文
[1]急性肺损伤后内源性肺干/祖细胞的动态变化及其修复作用[D]. 李海胜.第三军医大学 2013
本文编号：3520554
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