脂多糖对离体大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞TMEM16A的影响

发布时间：2017-05-14 15:24

  本文关键词：脂多糖对离体大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞TMEM16A的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：急性肺损伤（acute lung injury，ALI)是指非心源性的各种肺内外因素导致的急性进行性呼吸衰竭,急性呼吸窘迫综合征（acute respiratorydistress syndrome，ARDS）是急性肺损伤的严重阶段，是一种常见危重症，病死率极高。主要特征是肺泡毛细管膜损伤造成弥漫性肺损伤，导致肺泡与间质内聚积大量富蛋白的水肿液。临床研究证实上皮细胞的损伤及肺泡液体清除力的下降是导致患者病死率升高的主要原因。因此减轻早期肺泡上皮损伤程度、提高肺泡液体清除力可有利于ARDS的治疗。 肺泡液体清除是一项综合功能，主要通过活性离子通道及完整上皮细胞的物理屏障维持相对干燥的肺泡环境。肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolarepithelial cells typeⅡ，ATⅡ）在肺泡液体清除方面发挥重要作用。离子和水跨肺泡上皮转运机制尚未明确，，研究表明钠离子通道(ENaC)、Na+-K+-ATP酶(NKA)、水通道(AQP)均参与肺泡液体清除并发挥重要作用。而氯离子通道对肺水清除的影响尚未完全清楚，已有研究证实囊性纤维化气道跨膜调节子(cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)作为氯离子通道对肺泡液体清除发挥作用。2008年Schroeder等研究证实跨膜蛋白16A（TMEM16A）是钙激活氯离子通道的分子基础。有研究表明TMEM16A参与上皮细胞的分泌功能，Yang等利用免疫组化的方法确认了TMEM16A在肺泡上皮细胞中有表达，但是有关TMEM16A对急性肺损伤时肺泡液体清除影响的研究甚少。 脂多糖（LPS）是细菌内毒素的主要成分，LPS大量及持续释放是引起ARDS发生、发展的重要因素。本实验通过LPS对离体大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞造成急性肺损伤模型，有助于进一步研究TMEM16A对急性肺损伤时肺泡液体清除的影响，本实验研究目的在于：1、分离、纯化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞并进行电镜及染色鉴定。2、从炎症因子的角度观察LPS刺激体外培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞造成上清液中IL-8的变化。3、观察不同时间及不同浓度LPS刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞引起的TMEM16A的mRNA的变化。 方法： 1选取清洁级健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只，体重为220±10g。按照Dobbs等提供的方法并适当改进分离大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT Ⅱ)，用IgG免疫粘附的方法纯化分离的细胞，①台盼蓝染色检测细胞活力及细胞计数板计数。②用电镜及AKP染色的方法鉴定ATⅡ。③用AKP染色的方法测定ATⅡ纯度。 2建立脂多糖对分离的ATⅡ损伤模型。ATⅡ分离、纯化后培养24h，分三组：Ⅰ组(正常对照组)加入等容积培养基；Ⅱ组LPS终浓度1μg/ml；Ⅲ组LPS终浓度10μg/ml。分别测定刺激4h、8h后各组指标的变化。①电镜观察比较各组ATⅡ超微结构的变化。②用ELISA的方法检测各组细胞上清液中IL-8表达水平。③用实时定量PCR法检测各组TMEM16AmRNA表达水平的差异。 结果： 1ATⅡ计数，鉴定及活力测定：细胞纯化后每只大鼠可得细胞（1.84±0.14）×107个，细胞活力为(93.69±1.16)％。AKP染色法检测纯化后细胞纯度为（84.66±1.47）％。电镜检测可证实提取细胞为ATⅡ。 2透射电镜检测可证实ATⅡ急性损伤造模成功，可见细胞变性，形态不规则，细胞表面微绒毛减少甚至消失，胞膜崩解，胞核固缩，胞质内各种细胞器明显减少，板层小体出现排空及脱落，细胞空泡增多。 3用ELISA的方法检测LPS损伤细胞的上清液中IL-8水平：体外培养的ATⅡ细胞经LPS(1、10μg/ml)作用4h后IL-8水平与正常对照组相比显著增强,8h后差别依然存在。 4用实时定量PCR法检测各组肺泡II型上皮细胞上TMEM16AmRNA表达结果：LPS浓度为1μg/ml组：在LPS刺激4h后TMEM16A的mRNA水平与对照组无明显变化（P＞0.05），在LPS刺激8h后TMEM16A的RNA水平与对照组有所增加（P＜0.05），LPS浓度为10μg/ml组在LPS刺激4h及8h后：TMEM16A的mRNA水平与对照组相比显著增强（P＜0.05）。 结论： 1本实验中原代大鼠肺泡II型上皮细胞分离提纯方法可以得到足够纯度和活力的细胞，以进行下一步实验。脂多糖可以成功复制体外肺泡Ⅱ型上皮细胞急性损伤模型。 2脂多糖单独作用于体外培养的ATⅡ可使细胞上清液中IL-8表达水平增加。 3LPS体外刺激ATⅡ使其TMEM16A的RNA表达增加，在一定时间及浓度内，其表达量且随LPS的浓度及刺激时间的增加而增加，TMEM16A作为氯离子通道可能参与了急性肺损伤时的离子转运功能。
【关键词】：TMEM16A 急性肺损伤 肺泡Ⅱ型上皮细胞 脂多糖 白介素-8
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10
• 材料与方法10-20
• 结果20-21
• 附图21-26
• 附表26-27
• 讨论27-31
• 结论31
• 参考文献31-34
• 综述34-45
• 参考文献40-45
• 致谢45-46
• 个人简历46

【参考文献】

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1 曾庆富,蒋海鹰,钱仲,孙去病;肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离纯化及原代培养[J];中华病理学杂志;1998年05期

  本文关键词：脂多糖对离体大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞TMEM16A的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：365556