沃尼妙林对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠TLR4和CD14表达的影响

发布时间：2017-05-14 19:18

  本文关键词：沃尼妙林对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠TLR4和CD14表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）属于临床常见危重症，容易引起急性、进行性加重的呼吸衰竭，一般由心源性以外的各种肺内外致病因素所导致。炎症反应是ALI的主要发病机制，内毒素（LPS）是炎症反应的首要致病因子，在LBP的存在下，LPS与靶细胞表面的CD14受体相结合，形成LPS-LBP-CD14的三联复合物。该复合物在MD-2协助下与TLR4作用，转导LPS信号到细胞内，激活MyD88、IRAK、TRAF6以及TIRAP、MAL，从而活化NF-κB和MAPKs信号转导通路，生成和释放多种细胞因子和炎症介质，产生以中性粒细胞浸润、微血管内皮细胞损伤和蛋白液体渗漏为特征的炎症反应，最终导致急性肺损伤的发生。 沃尼妙林（Valnemulin，VA）是新一代广谱的截短侧耳素类半合成抗生素，属二萜烯类，是动物专用抗生素。关于LPS诱导的ALI方面的报道主要围绕在LPS信号转导通路的下游，有研究证实沃尼妙林可以通过降低单核细胞、巨噬细胞等分泌和释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）等炎性相关因子，起到有效保护ALI的作用。本研究旨在通过实时荧光定量RT-PCR和Western Blot在细胞水平以及在体水平上探讨ALI中沃尼妙林对LPS信号转导通路上游受体TLR4和CD14表达的影响。首先利用LPS诱导的小鼠单核-巨噬细胞（RAW264.7）体外炎症模型，探索沃尼妙林对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4和CD14表达的影响，发现LPS刺激RAW264.7细胞后，，可导致TLR4和CD14表达的增高；不同浓度的沃尼妙林预处理能够剂量依赖性的抑制LPS诱导的TLR4和CD14的表达。此外，为了对沃尼妙林的临床疗效提供客观的评价指标，我们进一步验证了沃尼妙林在体内的抗炎作用。利用LPS诱导构建的小鼠急性肺损伤模型，探索沃尼妙林对急性肺损伤小鼠肺组织TLR4和CD14表达的影响，发现沃尼妙林可以抑制LPS诱导的急性肺损伤小鼠TLR4和CD14的表达，并且表达抑制呈剂量依赖性。 该研究表明沃尼妙林有可能通过抑制LPS信号通路的上游受体TLR4和CD14的表达而实现抗炎和对急性肺损伤的保护作用。
【关键词】：急性肺损伤 沃尼妙林 脂多糖 TLR4 CD14
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 目录6-11
• 第一章 文献综述11-31
• 1.1 LPS 介导的跨膜信号转导通路的研究进展11-21
• 1.1.1 LPS11
• 1.1.2 与 LPS 跨膜信号转导有关的各种受体11-21
• 1.2 急性肺损伤的研究进展21-27
• 1.2.1 概述21-22
• 1.2.2 病因22
• 1.2.3 发病机制22-23
• 1.2.4 临床表现23
• 1.2.5 诊断标准23
• 1.2.6 急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征与炎症23-24
• 1.2.7 急性肺损伤模型24-25
• 1.2.7.1 直接肺损伤模型24-25
• 1.2.7.2 间接肺损伤模型25
• 1.2.7.3 其他模型25
• 1.2.8 预防和治疗25-27
• 1.2.8.1 原发病的治疗26
• 1.2.8.2 循环支持治疗26-27
• 1.3 沃尼妙林的研究进展27-31
• 1.3.1 概述27-28
• 1.3.2 抗菌机理28
• 1.3.3 药理学28-29
• 1.3.3.1 药效学28
• 1.3.3.2 药动学28-29
• 1.3.3.3 毒理学29
• 1.3.4 制剂29
• 1.3.5 合成方法29-30
• 1.3.6 检测方法30
• 1.3.7 临床应用30-31
• 第二章 沃尼妙林对脂多糖诱导的 RAW264.7 细胞 TLR4 和 CD14 表达的影响31-49
• 2.1 材料31-33
• 2.1.1 细胞31
• 2.1.2 药品和试剂31-32
• 2.1.3 仪器设备32-33
• 2.2 实验方法33-39
• 2.2.1 细胞培养33
• 2.2.2 LPS 诱导 RAW264.7 细胞 TLR4 和 CD14 mRNA 和蛋白表达的时间效应33-38
• 2.2.2.1 细胞培养和处理33
• 2.2.2.2 实时荧光定量 RT-PCR 检测 RAW264.7 细胞 TLR4 和 CD14 mRNA 的表达33-36
• 2.2.2.2.1 细胞总 RNA 的提取33-34
• 2.2.2.2.2 cDNA 第一条链的合成34-35
• 2.2.2.2.3 Real-Time PCR 扩增35-36
• 2.2.2.3 Western Blot 检测 RAW 264.7 细胞 TLR4 和 CD14 蛋白的表达36-38
• 2.2.2.3.1 细胞蛋白的提取36
• 2.2.2.3.2 BCA 蛋白分析法测定蛋白浓度36-37
• 2.2.2.3.3 SDS-PAGE 电泳37
• 2.2.2.3.4 封闭免疫37-38
• 2.2.2.3.5 显影38
• 2.2.2.4 统计学处理38
• 2.2.3 沃尼妙林对 LPS 诱导 RAW 264.7 细胞 TLR4 和 CD14 mRNA 和蛋白表达的影响38-39
• 2.2.3.1 细胞培养和处理38
• 2.2.3.2 实时荧光定量 RT-PCR 检测 RAW264.7 细胞 TLR4 和 CD14 mRNA 的表达38-39
• 2.2.3.3 Western Blot 检测 RAW 264.7 细胞 TLR4 和 CD14 蛋白的表达39
• 2.2.3.4 统计学处理39
• 2.2.4 不同浓度的沃尼妙林对 LPS 诱导 RAW 264.7 细胞 TLR4 和 CD14 mRNA 和蛋白表达的影响39
• 2.2.4.1 细胞培养和处理39
• 2.2.4.2 实时荧光定量 RT-PCR 检测 RAW264.7 细胞 TLR4 和 CD14 mRNA 的表达39
• 2.2.4.3 Western Blot 检测 RAW 264.7 细胞 TLR4 和 CD14 蛋白的表达39
• 2.2.4.4 统计学处理39
• 2.3 结果39-46
• 2.3.1 LPS 诱导 RAW264.7 细胞 TLR4 和 CD14 mRNA 和蛋白表达的时间效应39-41
• 2.3.2 沃尼妙林对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞 TLR4 和 CD14 mRNA 和蛋白表达的影响41-44
• 2.3.3 不同浓度沃尼妙林对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞 TLR4 和 CD14 mRNA 和蛋白表达的影响44-46
• 2.4 讨论46-47
• 2.5 小结47-49
• 第三章 沃尼妙林对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺组织TLR4 和 CD14 表达的影响49-57
• 3.1 材料49
• 3.1.1 实验动物49
• 3.1.2 药品和试剂49
• 3.1.3 仪器设备49
• 3.2 实验方法49-50
• 3.2.1 实验分组49
• 3.2.2 实时荧光定量 RT-PCR 检测急性肺损伤小鼠肺组织 TLR4 和 CD14 mRNA 的表达49-50
• 3.2.2.1 肺组织总 RNA 的提取49-50
• 3.2.2.2 cDNA 第一条链的合成50
• 3.2.2.3 Real-Time PCR 扩增50
• 3.2.3 Western Blot 检测急性肺损伤小鼠肺组织 TLR4 和 CD14 蛋白的表达50
• 3.2.3.1 肺组织蛋白的提取50
• 3.2.3.2 BCA 蛋白分析法测定蛋白浓度50
• 3.2.3.3 SDS-PAGE 电泳50
• 3.2.3.4 封闭免疫50
• 3.2.3.5 显影50
• 3.2.4 统计学处理50
• 3.3 结果50-53
• 3.3.1 实时荧光定量 RT-PCR 检测急性肺损伤小鼠肺组织 TLR4 和 CD14 mRNA 的表达50-51
• 3.3.2 Western Blot 检测急性肺损伤小鼠肺组织 TLR4 和 CD14 蛋白的表达51-53
• 3.4 讨论53-55
• 3.5 小结55-57
• 附录57-59
• 参考文献59-69
• 致谢69-71
• 个人简历71
• 个人情况71
• 教育背景71
• 科研经历（该论文项目来源）71
• 在学期间发表论文71

【参考文献】

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本文编号：366044