AECOPD患者病情严重程度与TNF-a、IL-10、RANTES水平的相关性研究

发布时间：2017-05-23 23:00

本文关键词：AECOPD患者病情严重程度与TNF-a、IL-10、RANTES水平的相关性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见而又严重危害人类健康的呼吸系统疾病，以气流受限呈进行性发展且不完全可逆为特征，是全球范围内发病率和死亡率增加的主要原因之一，造成了严重的经济和社会负担，这种情况日益加重[1]。目前临床上尚缺乏能够适时、准确评估AECOPD(acute exacerbation of COPD)的发生、发展及预后的指标，研究能够判断AECOPD发生、发展及预后的敏感指标具有重要意义。感染是COPD发生发展的重要因素。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）可以通过刺激机体各种免疫细胞产生大量的细胞炎症介质，引起机体的一系列炎症反应。P38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）是参与细胞内信号传导的重要激酶，介导炎症反应，在LPS导致的炎症瀑布反应中发挥重要作用[2]。p38MAPK抑制剂SB203580可抑制LPS所致肺部的炎症反应。本实验以健康人和AECOPD病人血清及外周血单个核细胞（peripheral bloodmononuclear cell, PBMC）为研究对象，观察健康对照组及不同程度AECOPD患者血清中TNF-a、IL-10、RANTES的水平及SB203580对LPS诱导的PBMCs分泌TNF-a、IL-10、RANTES水平的影响。探讨AECOPD病情严重程度与细胞因子TNF-a、IL-10、RANTES的相关性，为临床预防、治疗AECOPD提供新的思路。方法： 1研究对象：选择2012年3月 2013年1月我院呼吸内一科住院的AECOPD患者及同期门诊体检证实的健康志愿者。按2011年中华医学会呼吸分会制定的COPD及急性加重期的诊断标准分为：（1）AECOPD组；（2）健康对照组。根据FEV1/FVC、FEV1%预计值和临床表现将AECOPD组进一步分为Ⅱ级（中度组）（50%≤FEV1%＜80%）,Ⅲ级（重度组）（50%＜FEV1%≤30%），Ⅳ级（极重度组）（FEV1%＜30%）。实验分组共4组：①健康对照组；②AECOPD中度组；③AECOPD重度组；④AECOPD极重度组。 2血清及PBMCs细胞上清TNF-a、IL-10、RANTES水平测定 2.1标本采集：所有入选的对照组及实验组（AECOPD患者）于清晨空腹采肘静脉血8ml，其中3ml注入干燥的真空非抗凝管中，以4℃3000r/min离心15min,吸取上清液至于EP管，于-80℃冰箱内保存，待测TNF-a、IL-10、RANTES的水平。另5ml血注入EDTA抗凝管中，用于PBMCs的分离。 2.2分离单个核细胞：用淋巴细胞分离液分离出每份血液中的单个核细胞。0.4%台盼蓝染色，排除无活性的细胞，活性细胞数＞95%可采用。用含10%小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度均为1×106/ml，备用。 2.3ELISA法测定血清中TNF-a、IL-10、RANTES浓度。 2.4ELISA法测定PBMCs细胞上清中TNF-a、IL-10、RANTES的含量变化。 3实验分组：首先将分别将各组分离的PBMCs计数后用含10%小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度到1×10~6/ml，于24孔板中孵育（37℃CO2孵箱中），实验共分5组。 3.1对照组：加入与实验组等体积无血清RPMI1640培养液; 3.2LPS组：终浓度1ug/ml LPS,刺激90min； 3.3LPS+SB5组：加入终浓度5μΜ SB203580，1小时后加入终浓度1ug/mlLPS，刺激90min； 3.4LPS+SB10组:加入终浓度10μΜ SB203580，1小时后加入终浓度1ug/ml LPS，刺激90min； 3.5LPS+SB15组:加入终浓度15μΜ SB203580，1小时后加入终浓度1ug/ml LPS，刺激90min。各实验组细胞刺激成功后，离心（1500r/min,4℃,10min）,收集细胞上清液。保存细胞上清液于-80℃冰箱内。ELISA法测定细胞上清中TNF-a、IL-10、RANTES的含量。结果： 1健康对照组及AECOPD患者血清细胞因子水平：（1）AECOPD患者三组之间血清TNF-a水平比较：重度组高于中度组（P0.05），极重度组高于重度组（P0.05）；AECOPD患者与健康对照组血清TNF-a水平比较：均明显高于对照组（P0.05）。（2）AECOPD三组之间血清RANTES水平比较：重度组、极重度组均高于中度组（P0.05）；AECOPD患者中度组、重度组、极重度组血清RANTES水平均明显高于对照组（P0.05）。（3）AECOPD患者中度组、重度组、极重度组血清IL-10水平均明显低于对照组（P0.01）；AECOPD患者三组之间血清IL-10水平无统计学差异（P＞0.05）。（4）AECOPD患者血清TNF-a、RANTES水平与FEV1%呈负相关（r=-0.957，P=0.00;r=-0.964, P=0.00）;IL-10水平与FEV1%呈正相关（r=0.656, P=0.00）。 2PBMCs上清细胞因子水平：（1）比较健康组及AECOPD中度组、重度组、极重度组PBMCs体外相同条件（加入等体积无血清RPMI1640）下分泌TNF-a、RANTES、IL-10的水平：细胞上清中IL-10含量比较：健康对照组高于AECOPD中度组（P0.05），中度组高于重度组（P0.05），重度组高于极重度组（P0.05）；细胞上清中TNF-a含量比较：中度组高于健康对照组（P0.05），重度组高于中度组（P0.05），极重度组高于重度组（P0.05）；细胞上清中RANTES含量比较：AECOPD极重度组细胞上清中RANTES含量高于健康组、中度组、重度组（P0.05），健康组与AECOPD中度组、重度组比较比细胞上清中RANTES含量无明显差异（P＞0.05），AECOPD中度组与重度组之间无显著差异（P＞0.05）。（2）体外不同刺激后比较PBMCs细胞上清中TNF-a、RANTES、IL-10含量：LPS刺激PBMCs后，健康组及AECOPD三组细胞上清液中TNF-a、RANTES含量较对照组增加（P0.05），而IL-10较对照组含量减低（P0.05）；健康人细胞上清中TNF-a、RANTES、IL-10含量：IL-10含量随SB203580处理浓度增加而增加均高于LPS组（P0.05），AECOPD三组中SB203580（5μΜ、10μΜ和15μΜ）预处理抑制LPS诱导的TNF-a、RANTES含量增加（P0.05）,但IL-10含量随SB203580预处理浓度增加而略增加，AECOPD三组之间比较无明显差异（P＞0.05）。数据以均数±标准差（(x|-)±s）表示。各组用单因素方差分析（One wayANOVA）进行比较。如有显著性用Student-Newman-Keuls（SNK-q）检验，P0.05表示有统计学意义。结论： 1血清中TNF-a、RANTES与AECOPD病情严重程度正相关，与肺功能呈负相关；IL-10水平与AECOPD病情严重程度负相关，与肺功能正相关。可见TNF-a、RANTES在COPD发生、发展中参与了气道炎症反应，可能是COPD急性加重的重要指标，，IL-10则发挥一定的抗炎作用。 2对照组与实验组LPS刺激外周血单个核细胞引起细胞上清中TNF-a、RANTES分泌增加；用p38MAPK抑制剂SB203580干预后，TNF-a、RANTES分泌减少，提示SB203580可能抑制TNF-a、RANTES分泌。IL-10水平略有增加，说明抑制p38MAPK，可能会减轻炎症反应，减少抗炎因子的消耗。
【关键词】：人外周血单个核细胞 慢性阻塞性肺疾病 脂多糖 p38丝裂原活化蛋白激酶 白介素-10 肿瘤坏死因子-a 趋化因子RANTES
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R563.9
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