壳聚糖及壳聚糖—酵母多糖复合微球抗大鼠PCP的研究

发布时间：2017-08-22 09:01

  本文关键词：壳聚糖及壳聚糖—酵母多糖复合微球抗大鼠PCP的研究

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【摘要】：背景和目的 肺孢子菌（pneumocystis）可寄生于有免疫缺陷的人和多种哺乳动物肺组织内，引起肺孢子菌性肺炎（pneumocystis pneumonia，PCP）。在人类PCP经常发生于AIDS、长期接受抗肿瘤药物和免疫抑制剂的患者。随着此类患者的增多，PCP患病率呈增多趋势，因此受到越来越多的关注。 目前PCP主要依靠药物治疗，常用的药物有磺胺甲基异恶唑-甲氧苄氨嘧啶（Trimethoprim-Sulfamethoxazole，Tmp-Smz）、潘他米丁、氨苯砜和阿托伐醌等。但是这些药物的治疗效果欠佳，并且存在不同程度的副作用，并随之出现了对这些药物的耐受性。因此研究新的抗PCP的药物变的日益迫切。 壳聚糖为一种多聚糖，通常是有甲壳素通过脱乙酰作用获得，壳聚糖制取方便并且具有好的生物学相容性、生物可降解性和无毒性。研究发现壳聚糖具有抗细菌和真菌的作用。酵母多糖为来自于酿酒酵母，可以作为Dectin-1受体的激活剂，从而起到免疫调节作用。研究发现Dectin-1受体具有抵抗肺孢子菌感染的作用，，而PCP患者出现Dectin-1受体表达下调，酵母多糖具有上调Dectin-1受体从而增强患者抗肺孢子菌感染的作用。但是目前为止没有将壳聚糖和酵母多糖应用于抗PCP研究的报道。本研究拟从壳聚糖具有抗菌作用和酵母多糖具有升高Dectin-1受体的作用为切入点，同时利用壳聚糖-酵母多糖微球的缓释作用，对其抗大鼠PCP的效果进行研究，此次研究将为壳聚糖和酵母多糖治疗PCP提供理论依据。 本研究目的在于在大鼠PCP模型体内探讨壳聚糖及壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP的治疗效果，并探讨相关的作用机制。 方法 1.大鼠PCP模型的构建和分组 通过每周两次给大鼠后腿肌注地塞米松磷酸钠的方式构建大鼠PCP模型。PCP大鼠模型构建成功后，随机将大鼠分为以下7组：免疫正常组、0.5%壳聚糖-免疫正常组、PCP模型组、0.1%壳聚糖组、0.5%壳聚糖组、0.2%乙酸组和Tmp-Smz组（Tmp0.0215mg/g和Smz0.11mg/g体重）。 2.在大鼠PCP模型中研究0.5%壳聚糖对PCP大鼠体重增加量、肺重、肺重/体重（lung weight/body weight，LW/BW）比率和存活率的影响药物治疗开始前和开始后分别对大鼠进行称重，处死大鼠后称量大鼠肺重。通过对大鼠体重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的研究，评估药物的治疗效果。 3.在大鼠PCP模型中研究0.5%壳聚糖对PCP大鼠肺组织的影响取大鼠肺组织进行苏木素-伊红（Hematoxylin and Eosin，HE）染色，通过光镜观察各组大鼠肺组织变化和炎症浸润。 4.扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）和透射电镜（transmission electron microscope，TEM）观察各组肺孢子菌的超微结构改变 取大鼠肺组织通过SEM和TEM观察药物对肺孢子菌的超微结构破坏。 5.实时荧光定量PCR检测大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量 取大鼠肺组织提取总RNA，定量PCR检测肺组织内肺孢子菌的HSP70mRNA表达量。 6. ELISA法检测各组大鼠血清内IL-10、TNF-α和IFN-γ细胞因子的含量 采集大鼠腹主动脉血，提取血清。用ELISA法检测药物对血清内IL-10、TNF-α和IFN-γ细胞因子含量的影响。 7.使用流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的含量 采集大鼠腹主动脉血，用流式细胞术检测药物对大鼠CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的影响。 8.大鼠PCP模型的构建和分组 通过每周两次给大鼠后腿肌注地塞米松磷酸钠的方式构建大鼠PCP模型。PCP大鼠模型构建成功后，随即将大鼠分为以下7组：免疫正常组、PCP模型组、0.5%壳聚糖组、0.5%壳聚糖+0.9%氯化钠组、0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组、0.5%壳聚糖+1%酵母多糖组、0.8%壳聚糖-酵母多糖微球组。 9.在PCP大鼠体内研究0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠体重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影响 治疗开始前和开始后分别对大鼠进行称重，处死大鼠后称量大鼠肺重。通过对大鼠体重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的研究，评估药物的治疗效果。 10.在PCP大鼠体内研究0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠肺组织的影响 取大鼠肺组织进行HE染色，通过光镜观察各组大鼠肺组织改变和炎症浸润。 11. TEM观察各组肺孢子菌的超微结构改变 取大鼠肺组织通过TEM观察药物对肺孢子菌的超微结构破坏。 12.实时荧光定量PCR检测各组大鼠肺组织内Dectin-1和TLR-4受体mRNA表达量 取大鼠肺组织提取RNA，定量PCR检测药物对大鼠肺组织内Dectin-1和TLR-4受体mRNA表达量的影响。 13.实时荧光定量PCR检测大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量 切取大鼠肺组织提取总RNA，定量PCR检测肺孢子菌的HSP70mRNA表达量。 14. ELISA法检测大鼠血清内细胞因子的含量 采取大鼠腹主动脉血，提取血清。用ELISA法观察药物对血清内IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ、MCP-1、IL-1α、IL-2、IL-6和TNF-α细胞因子含量的影响。 结果 1.0.5%壳聚糖对PCP大鼠体重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影响 0.5%壳聚糖治疗后大鼠体重增加量明显高于PCP模型组、0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组；0.5%壳聚糖治疗后大鼠肺重和LW/BW比率明显低于PCP模型组、0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组。0.5%壳聚糖治疗后大鼠存活率高于PCP模型组和0.2%乙酸组。 2.0.5%壳聚糖对PCP大鼠肺组织的影响 0.5%的壳聚糖治疗后，PCP大鼠肺组织内炎细胞和巨噬细胞明显减少，肺泡腔内无泡沫样物质，而PCP模型组、0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组肺组织内可见大量炎细胞浸润并可见泡沫样物质形成。 3.0.5%壳聚糖对肺孢子菌超微结构的影响 0.5%的壳聚糖治疗后，电镜下肺孢子菌的超微结构表现出明显的破坏，可见核固缩、胞膜表面结构不完整。 4.0.5%壳聚糖对PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量的影响 0.5%的壳聚糖治疗后，PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量明显低于PCP模型组，0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组。 5.0.5%壳聚糖对PCP大鼠血清IL-10、TNF-α和IFN-γ细胞因子含量的影响 0.5%的壳聚糖治疗后PCP大鼠血清内IL-10、IFN-γ细胞因子的含量明显高于PCP模型组，0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组，而TNF-α细胞因子的含量明显低于PCP模型组，0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组。 6.0.5%壳聚糖对PCP大鼠动脉血内CD4+T和CD8+T淋巴细胞的影响 0.5%的壳聚糖治疗后与PCP模型组、0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组相比明显提高了PCP大鼠动脉血内CD4+T淋巴细胞含量，与PCP模型组和0.2%乙酸组相比降低了CD8+T淋巴细胞含量。 7.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠体重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影响 0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后与PCP模型组、0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组相比明显提高了PCP大鼠的体重增加量，并且降低了PCP大鼠的肺重和LW/BW比率。0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后大鼠存活率高于模型组。 8.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠肺组织的影响0.8%的壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后与PCP模型组、0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组相比PCP大鼠肺组织内炎细胞明显减少。 9.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠肺组织内Dectin-1和TLR-4受体mRNA表达量的影响 0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后与PCP模型组、0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组相比明显提高了PCP大鼠肺组织内Dectin-1受体mRNA和降低了PCP大鼠肺部TLR-4受体mRNA的表达量。 10.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量的影响 0.8%的壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后，PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量明显低于PCP模型组，0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组。 11.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠血清内细胞因子的影响 0.8%的壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后PCP大鼠血清内IL-1β、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子的含量明显高于PCP模型组、0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组，而IL-1α、IL-6和TNF-α细胞因子的含量明显低于PCP模型组、0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组。0.8%的壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后PCP大鼠血清内MCP-1细胞因子的含量明显高于PCP模型组，IL-2细胞因子的含量明显低于PCP模型组。 结论 1.0.5%的壳聚糖可以减少PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量、降低LW/BW比率、减轻肺部炎症浸润，并且能够增加血清内IFN-γ、IL-10细胞因子含量和CD4+T淋巴细胞数量，减少CD8+T淋巴细胞数量和TNF-α细胞因子含量，并且还能够引起肺孢子菌超微结构破坏。 2.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球可以减少PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量、TLR-4受体mRNA表达量、降低LW/BW比率、减轻肺部炎症浸润，并且能够增加PCP大鼠肺组织内Dectin-1受体mRNA表达量和血清内IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ和MCP-1细胞因子含量，减少了血清内IL-1α、IL-2、IL-6和TNF-α细胞因子含量，并且还能够引起肺孢子菌超微结构破坏。
【关键词】：肺孢子菌肺炎 大鼠 壳聚糖 壳聚糖-酵母多糖复合微球
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563.1
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 摘要7-15
• ABSTRACT15-25
• 第一部分 壳聚糖抗大鼠 PCP 的研究25-62
• 前言25-26
• 1 试验材料和试验方法26-38
• 2 结果38-52
• 3 讨论52-55
• 4 结论55-56
• 参考文献56-62
• 第二部分 壳聚糖-酵母多糖复合微抗大鼠 PCP 的研究62-97
• 前言62-63
• 1 试验材料和试验方法63-69
• 2 结果69-86
• 3 讨论86-90
• 4 结论90-91
• 参考文献91-97
• 全文总结97-98
• 文献综述98-108
• 参考文献104-108
• 致谢108-109
• 攻读博士学位期间发表的论文109-110

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 ;Molecular phylogeny of Pneumocystis based on 5.8S rRNA gene and the internal transcribed spacers of rRNA gene sequences[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2008年05期

2 叶彬,郑玉强,武卫华,张静;Iron chelator daphnetin against Pneumocystis carinii in vitro[J];Chinese Medical Journal;2004年11期

3 叶彬,陈雅棠,刘成伟;青蒿素衍生物对卡氏肺孢子虫基因的影响[J];中国人兽共患病杂志;2002年01期

4 安春丽,苏晓平,A.G.Harmsen;CD8~+ T细胞在CD4~+ T细胞耗竭小鼠卡氏肺孢子虫肺炎的致病作用(英文)[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2000年04期

本文编号：718211