粘着斑激酶通过整合素β1对肺成纤维细胞迁移的影响机制

发布时间：2017-08-26 12:26

  本文关键词：粘着斑激酶通过整合素β1对肺成纤维细胞迁移的影响机制

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【摘要】：目的:研究粘着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)通过整合素β1对肺成纤维细胞迁移影响的效果和机制。方法:1.细胞实验1.1人肺成纤维细胞(Human Lung Fibroblasts,HLFs)从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)购买。细胞在含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、2mM/L谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100单位/ml链霉素、100单位/ml庆大霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)保存和传代。培养至第7-9代用于实验。细胞重悬于DMEM中,接种到纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)包被的培养板中,按各组的实验要求干预、培养、裂解细胞,收集全细胞裂解液备用,或者行细胞划痕实验。1.2免疫印迹实验(Western blot,WB)检测FAK的激活率,Western blot结合免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)实验检测整合素β1是否与FAK结合,细胞划痕实验测定HLFs在FN上的迁移功能。2.动物实验2.1 8-11周龄C57BL/6小鼠分4组:正常对照组,PF-573228对照组,博莱霉素(Bleo)组,PF-573228干预组。小鼠被麻醉后,以Bleo(3 U/公斤体重,只小鼠的剂量用生理盐水配至50μl)或生理盐水(50μl/只)缓慢经气管注射。随后正常对照组和Bleo组每日经腹腔注射0.2ml生理盐水,PF-573228对照组和PF-573228干预组每日经腹腔注射PF-573228(50mg/kg,每只小鼠的剂量用生理盐水配至0.2ml)。21天后获取小鼠肺组织,肺组织用于病理学、蛋白组学检查及检测全肺羟脯氨酸。2.2肺病理组织标本HE(Hematoxylin-Eosin,HE)染色用于阿什克罗夫特(Ashcroft)评分,全肺组织检测羟脯氨酸含量,Western blot检测FN、Ⅰ型前胶原蛋白(Procollagen TppeⅠProtein,Pro-Col1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)评价肺纤维化的程度;westernblot检测rac、fak的激活率和s100a4表达,评价肺组织中肺成纤维细胞的迁移程度。3.统计学方法数据以均数±标准差表示,并使用独立样本t检验或配对t检验统计分析(用于两组间的比较)。细胞实验重复三至四次,动物实验每个实验组或对照组包含5到6只动物,重复两次,p0.05具有统计学意义。结果:1.血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor-bb,pdgf-bb)诱导hlfs过程中调节fak激活及调节fak与整合素β1结合的机制pdgf-bb诱导fak激活呈双峰样改变,第一个是较低的峰值pdgf-bb的浓度在0.1-0.5ng/ml的范围,第二个是最高峰值pdgf-bb的浓度在1-5ng/ml的范围。给予2ng/mlpdgf-bb诱导hlfs时,fak激活最早发生在诱导后的6分钟。fak早期有一定幅度的激活发生在pdgf-bb诱导后的30分钟。随后fak激活有下降趋势,但于pdgf-bb诱导后5小时fak激活再逐步增加,并于pdgf-bb诱导后20小时达到顶峰。pdgf-bb以剂量依赖性的方式诱导hlfs迁移。在hlfs培养过程中,如果没有pdgf-bb的诱导fak与整合素β1无关联(图2-7)。在pdgf-bb诱导下,fak与整合素β1直接结合,这种结合在pdgf-bb诱导10个小时达到高峰。2.fak抑制剂对pdgf-bb诱导hlfs迁移,及对fak与整合素β1结合的影pdgf-bb诱导迁移率(每24小时伤口覆盖区域)与其被使用的剂量呈正相关,诱导迁移率最高的pdgf-bb范围为1-5ng/ml。pdgf-bb诱导hlfs迁移也是时间依赖的方式。pdgf诱导5个小时和24小时后迁移率分别显著增加(p0.01)。pf-573228抑制pdgf-bb诱导fak激活(py397offak)和抑制pdgf-bb诱导的hlfs迁移的剂量依赖性的方式。给予fak抑制剂并没有阻止fak与整合素β1结合,pf-573228即使在能有效地抑制pdgf-bb诱导fak激活和hlfs迁移的剂量(1或5μm)下仍没有影响fak-整合素β1结。3.整合素β1在fak激活和fak调控hlfs迁移中的功能与对照免疫球蛋白组相比,整合素β1抑制性抗体减少约85%的迁移(p0.001)。整合素α5或α4抑制性抗体抑制约50%的hlfs在fn上迁移。阻断整合素αvβ3、αvβ6或αvβ8,各抑制HLFs在FN上约5%的迁移。整合素β1抑制性抗体明显阻断PDGF-BB-诱导的FAK的激活。当HLFs接种到FN上没有PDGF-BB诱导时,整合素β1抑制性抗体或对照免疫球蛋白G组没有影响FAK基本的激活。整合素β1阻断抗体中断了PDGF-BB诱导HLFs中FAK与整合素β1联系。4.FAK抑制剂PF-573228对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的干预效果及机制研究肺组织的形态学分析揭示FAK抑制剂干预组与Bleo组相比Ashcroft肺纤维化评分大约下降1.2分(p0.01)。检测羟脯氨酸替代总胶原蛋白在整个肺组织含量,FAK抑制剂干预组较Bleo组总胶原蛋白水平显著降低(p0.01)。FAK抑制剂干预组与Bleo组相比,FAK抑制剂显著抑制FAK和Rac激活,和显著降低S100A4表达,显著降低整个肺FN和Pro-Col1含量,显著降低肌成纤维细胞的标志物α-SMA的表达。结论:1.PDGF-BB以剂量依赖和时间依赖的方式激活FAK,并且使FAK被招募后直接与整合素β1结合。2.FAK抑制剂PF-573228以剂量依赖和时间依赖的方式抑制PDGF-BB诱导FAK的激活,并可能通过此机制抑制PDGF-BB诱导的HLFs迁移。FAK与整合素β1相结合可能为FAK激活的上游信号。3.整合素β1在PDGF-BB诱导人肺HLFs迁移过程中发挥主要作用,整合素β1粘附在FN上对FAK和整合素β1结合,以及对随后PDGF-BB诱导FAK的激活都是必不可少的。4.FAK抑制剂通过抑制HLFs的迁移、抑制细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)蛋白质产生、抑制肌HLFs的分化,从而抑制肺纤维化病变的发展。5.FAK信号通路是治疗特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)潜在的靶点。
【关键词】：粘着斑激酶 整合素β1 纤维化 迁移 细胞生物学
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-15
• 第一部分 PDGF-BB诱导HLFs过程中调节FAK激活及调节FAK与整合素 β1 结合的机制研究15-28
• 1 材料15-17
• 2 方法与步骤17-23
• 3 结果23-25
• 4 讨论25-28
• 第二部分 FAK抑制剂对PDGF-BB诱导HLFs迁移功能的影响28-36
• 1 材料28
• 2 方法与步骤28-32
• 3 结果32-35
• 4 讨论35-36
• 第三部分 不同整合素在PDGF-BB诱导HLFs迁移过程中的功能差异及整合素 β1抗体对FAK功能的影响36-43
• 1 材料36
• 2 方法与步骤36-39
• 3 结果39-41
• 4 讨论41-43
• 第四部分 FAK抑制剂PF-573228对Bleo诱导小鼠肺纤维化的干预效果及机制研究43-55
• 1 材料43-44
• 2 实验方法与步骤44-49
• 3 结果49-53
• 4 讨论53-55
• 参考文献55-60
• 综述60-74
• 参考文献67-74
• 攻读学位期间发表的学术论文、论著及承担的课题74-76
• 缩略语表76-77
• 致谢77-79

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 郑金旭;管淑红;许清;汤艳;刘继柱;吕晓婷;;Ⅱ型肺泡上皮细胞转染Napsin A基因对肺纤维化的干预作用[J];中华医学杂志;2010年46期

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本文编号：741491