BTBD7基因在磨牙牙根发育过程中的表达及其作用

发布时间：2017-10-12 03:20

  本文关键词：BTBD7基因在磨牙牙根发育过程中的表达及其作用

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【摘要】：牙齿发育是一个连续而且复杂的过程。牙胚是研究牙齿发育的理想模型。牙齿发育包括牙冠发育、牙根发育和牙周组织的发育三个部分。其中牙根发育在牙齿发育中占有重要地位,是不可缺少的部分。目前研究牙根发育主要是研究牙根发育的初始阶段,对牙根发育中期特别是牙根发育形成根分叉时相对较少。赫特维希上皮根鞘一般被认为是牙根发育的重要决定因素。而发育期根端复合体作为一个有功能的整体,其组织结构在牙齿发育中具有重要作用。研究发现Btbd7基因所表达的蛋白对关键器官如肺脏、唾液腺分支结构的发育至关重要。其作用主要是遏制钙黏附蛋白,从而使细胞分散形成分支。如果Btbd7基因受到抑制,那么唾液腺的分支发育就会受到严重影响。Btbd7蛋白控制着唾液腺和肺脏生长的上皮细胞分支。Btbd7能够抑制细胞之间的相互粘附,从而使器官发育形成分支。因此我们推测在牙根发育过程中,BTBD7基因是否也有表达,有的话那它的表达会如何影响牙根数目的发育?关于这方面的报道目前还没有。为了确定Btbd7基因在牙的发育过程中是否有表达,如果有表达,那主要表达在什么部位,我们首先用免疫组化方法检测了Btbd7基因在根端复合体中的表达位置。确定了其在上皮根鞘区域有明显表达,且在磨牙形成根分叉时表达更明显。为了进一步确定这种作用,我们提取了出生8天时的幼鼠上皮根鞘细胞,通过RT-PCR和Western blot检测切牙和磨牙中Btbd7基因的表达,以明确Btbd7基因与多根牙形成的相关性。目的：研究在单根牙和多根牙牙齿发育过程Btbd7基因在上皮根鞘中的表达变化,以观察Btbd7基因对牙齿发育过程中多根牙形成的影响,探讨其在此过程中所起的作用。方法：1.选取出生后第5天、第8天、第11天、第15天和第19天的Wistar大鼠幼崽,脱颈处死后解剖出上下颌骨。然后分离解剖出其切牙及第一磨牙的牙胚。制作石蜡切片,然后进行苏木精—伊红染色,查看牙根在不同时期的发育情况。免疫组化分别检测切牙和磨牙牙胚中Btbd7基因的时空表达及差异。2.取出生后8天的幼鼠3只,脱颈处死后剥出上下颌骨内前牙和第一恒磨牙的牙胚组织。然后切下牙冠硬组织边缘的部分组织,Ⅰ型胶原酶消化和胰蛋白酶消化,进行原代细胞培养。然后用差速消化法得到上皮根鞘细胞,这时上皮细胞较纯。最后用CK14和Vimentin进行细胞鉴定。3.用RT-PCR方法检测BTBD7基因在磨牙和切牙上皮根鞘细胞中mRNA的表达变化。4.用Western blot方法检测BTBD7基因在磨牙和切牙上皮根鞘细胞中蛋白的表达变化结果：1.HE染色显示幼鼠出生后第5天,磨牙牙冠发育接近完成,牙尖部分开始钙化,在牙颈部区域形成的突出结构是颈环,但此时没有明显的上皮根鞘结构,而牙根尚未开始发育；幼鼠出生后第8天,磨牙牙冠基本发育完成,牙根开始发育,颈环处内釉上皮和外釉上皮开始增生,可见上皮根鞘结构；幼鼠出生后第11天,磨牙牙根区上皮根鞘继续生长,形成上皮隔,并且有一部分发生断裂；幼鼠出生后第15天,磨牙牙冠发育完成,牙根发育完成约2/3,可见根分叉结构；幼鼠出生后第19天,磨牙牙根已基本发育完成,可见明显的双根结构。而在这一阶段内,切牙牙冠发育基本完成,但牙根并不继续发育,而是逐渐形成釉质。免疫组化染色显示在幼鼠出生后第5天,Btbd7基因在磨牙牙胚颈环处无明显表达；幼鼠出生后第8天,Btbd7基因主要表达在上皮根鞘区域,切牙中Btbd7基因在上皮根鞘中呈现弱阳性表达,而磨牙中Btbd7基因在上皮根鞘中的表达呈现强阳性。幼鼠出生后第11天,Btbd7基因主要表达在磨牙断裂的上皮根鞘细胞中,且表达不甚明显。幼鼠出世后第15天,Btbd7基因在磨牙上皮根鞘细胞中表达不甚明显。幼鼠出生后第19天,Btbd7基因已无明显表达。2.上皮根鞘细胞生长良好,主要为多边形,细胞聚集在一起互相接触类似铺路石样。CK14染色呈现阳性,细胞内细胞质可被染成棕褐色。3. RT-PCR结果表明,磨牙上皮根鞘细胞中Btbd7基因mRNA的表达比切牙上皮根鞘细胞中Btbd7基因mRNA的表达明显要高4.蛋白印迹实验(Western blot)结果证实,磨牙上皮根鞘细胞中Btbd7基因蛋白的表达比切牙上皮根鞘细胞中Btbd7基因蛋白的表达明显要高。结论：Btbd7基因在磨牙的牙根发育过程中参与了根分叉的形成,与牙根发育形成多根牙有相关性。
【关键词】：Btbd7基因 牙根发育 赫特维希上皮根鞘 上皮根鞘细胞
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R333.1
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-14
• 前言14-17
• 实验一：Btbd7基因在大鼠切牙及磨牙牙根发育早期根端复合体中的表达变化17-20
• 材料与方法17-19
• 结果19-20
• 实验二：上皮根鞘细胞的分离、培养与鉴定20-23
• 材料与方法20-22
• 结果22-23
• 实验三：BTBD7基因在磨牙和切牙上皮根鞘细胞中mRNA表达变化23-26
• 材料与方法23-25
• 结果25-26
• 实验四：BTBD7基因在磨牙和切牙上皮根鞘细胞中蛋白表达变化26-28
• 材料与方法26-28
• 结果28
• 结论28-29
• 讨论29-35
• 附图35-41
• 参考文献41-45
• 致谢45-46
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录46-47
• 学位论文评阅及答辩情况表47

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