结核分枝杆菌PPE家族基因Rv3136影响胞壁重塑及其分子机理

发布时间：2017-10-22 04:30

  本文关键词：结核分枝杆菌PPE家族基因Rv3136影响胞壁重塑及其分子机理

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【摘要】：结核分枝杆菌被认为是较成功和广泛分布的胞内病原菌之一,将近有三分之一的世界人口感染,每年死亡人数高达150万。根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)最新公布的《2015年全球结核病报告》统计数据结果显示,2014年结核病在全球范围夺去了150万人的生命,其中110万为HIV阴性患者,40万是HIV阳性的结核病患者。在2014年,WHO估算全球新发结核病例是960万,而这包括了约540万男性、320万女性以及100万的儿童,更可怕的是12%的新发病例是HIV阳性患者。而这庞大的数据结果表明,我国依然是结核病高发国家,仅次于印度(220万)和印度尼西亚(100万)而位居全球第三位。而耐药形势依旧不容乐观,2014年,WHO估算全球新发生48万MDR-TB(Multidrug-resistant TB,MDR-TB)病例,其中只有约四分之一病例被检测和报告。虽然有抗结核的新药物及疫苗不断出现,但是随着耐药结核菌的出现以及与HIV的共感染,愈是加剧了预防和治疗结核病的困难。结核分枝杆菌,这一古老的病原菌,有着独特细胞壁,主要由脂质类和糖类组成,为亲水性药物提供了一个渗透屏障,并对于其自身的存活和毒力有着重要的作用。这个大分子结构,即枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖,磷脂酰-肌红蛋白-肌醇为基础的脂聚糖,是分枝杆菌细胞壁的主要特点。这些细胞壁成分的组装是过程是开发新型抗结核药物的潜在靶标。而这些组成成分的生物合成过程中的调控通路同样也是寻找新药靶的潜在对象。结核分枝杆菌PPE(Pro-Pro-Glu)家族代表了一类独特的分枝杆菌蛋白,有180个氨基酸组成的保守N末端,共有69个成员。目前报道的大部分PPE蛋白因为其特有的PPE结构域,均亚细胞定位在细胞表面。尽管一些PPE蛋白被报道参与在宿主先天免疫作用或者对于细菌的毒力有着重要的关系,但是大部分的功能目前尚未阐明。其中家族成员PPE51(Rv3136)仍然是功能未知的蛋白。为了探索Rv3136基因在分枝杆菌中的所编码蛋白的功能,在本研究中,我们以分枝杆菌非致病性快速生长型模式菌株—耻垢分枝杆菌为研究对象,异源表达了Rv3136基因获得了重组耻垢分枝杆菌MS_Rv3136。本研究阐述了PPE家族成员PPE51(Rv3136)对分枝杆菌的细胞壁重塑的影响。通过实验研究证明,Rv3136不是分泌蛋白而是亚细胞定位在细菌细胞壁上。Rv3136基因能够明显的改变细菌菌落表型、滑动能力以及生物膜的稳定状态,暗示着该基因可能会与细胞壁的组成成分相关联。在各种压力环境(SDS、酸性环境、H2O2和联胺)下,重组耻垢分枝杆菌MS_Rv3136均表现出明显的生长优势。此外,当把该重组菌暴露于胞壁相关的抗生素(异烟肼和万古霉素)下的时候,其表现出耐受表型。溴化已锭摄入实验证明了细胞壁的渗透性发生了改变。为了进一步探索Rv3136是否因为影响细胞壁成分的组成进而增强分枝杆菌在体内的存活率,我们将重组耻垢分枝杆菌感染人源巨噬细胞(THP-1),结果发现Rv3136同样增强了耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活力。之后我们检测了该重组菌株中与胞壁成分相关的几个基因在转录水平上的表达情况,结果显示过表达Rv3136基因后显著上调了glfT2(MSMEG_6403),glfT1(MSMEG_6367),mptA(MSMEG_4241),mgtA(MSMEG_1113),ubiA(MSMEG_6401)和pimB(MSMEG_4253)以及sigF(MSMEG_1804)。这几个基因分别是与细胞壁上组成成分有着重要关联。综上所述,我们所得的实验结果表明,PPE家族成员Rv3136蛋白可能与结核分枝杆菌细胞壁成分组成相关,而这将为PPE家族蛋白添加新功能,同时也为进一步研究结核分枝杆菌细胞壁结构的重塑机制研究奠定了基础。
【关键词】：结核分枝杆菌 PPE家族 细胞壁 Rv3136 胞内存活
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第1章 文献综述10-19
• 1.1 结核分枝杆菌细胞壁的组成和特征11-12
• 1.2 合成结核菌细胞壁的基因及途径12-16
• 1.2.1 分枝杆菌枝菌酸的合成12-13
• 1.2.2 分枝杆菌肽聚糖的合成13-14
• 1.2.3 分枝杆菌阿拉伯半乳聚糖的合成14
• 1.2.4 分枝杆菌磷脂酰甘露糖苷，脂甘露聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖的生物合成14-16
• 1.2.5 细胞分裂过程中细胞壁的合成16
• 1.3 细胞壁合成的调控16-17
• 1.4 展望17-19
• 第2章 前言19-21
• 第3章 实验材料和方法21-36
• 3.1 实验材料21-24
• 3.1.1 实验菌株、载体和细胞21
• 3.1.2 实验用主要试剂21-22
• 3.1.3 培养基及实验试剂的配制22-23
• 3.1.4 实验仪器设备23-24
• 3.2 实验方法24-36
• 3.2.1 设计与合成引物24
• 3.2.2 目的基因的获得24-25
• 3.2.3 目的基因Rv3136的TA克隆25
• 3.2.4 大肠杆菌DH5a、BL21和JM109感受态制备及转化25-26
• 3.2.5 Rv3136重组蛋白的表达26-27
• 3.2.6 耻垢分枝杆菌感受态制备及转化27-28
• 3.2.7 Western blot检测重组蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达28-29
• 3.2.8 Rv3136（PPE51）重组蛋白在耻垢分枝杆菌中的亚细胞定位分析29-30
• 3.2.9 重组耻垢分枝杆菌菌落形态观察30
• 3.2.10 耻垢分枝杆菌生物膜培养30
• 3.2.11 滑动实验30
• 3.2.12 扫描电镜观察重组耻垢分枝杆菌菌体形态30-31
• 3.2.13 重组耻垢分枝杆菌在酸性条件下的存活影响31
• 3.2.14 重组耻垢分枝杆菌对SDS耐受性检测31-32
• 3.2.15 重组耻垢分枝杆菌对氧化压力的影响32
• 3.2.16 溴化已锭（EB）摄入实验32-33
• 3.2.17 重组耻垢分枝杆菌侵染巨噬细胞后胞内存活率及细胞因子检测33-34
• 3.2.18 Rv3136对胞壁相关基因转录水平的影响34-36
• 第4章 结果与分析36-50
• 4.1 RV3136在致病分枝杆菌中是保守蛋白36
• 4.2 RV3136目的基因扩增和鉴定36-37
• 4.3 构建大肠杆菌BL21-PET28-RV3136表达菌株37-38
• 4.4 RV3136重组蛋白在大肠杆菌BL21中表达成功38
• 4.5 成功构建重组耻垢分枝杆菌MS_RV313638-39
• 4.6 RV3136定位在耻垢分枝杆菌细胞壁上39-40
• 4.7 MS_RV3136菌落形态观察和生物膜形成40-41
• 4.8 过表达RV3136基因对耻垢分枝杆菌滑动能力的影响41
• 4.9 过表达RV3136基因对耻垢分枝杆菌菌体形态的影响41-42
• 4.10 过表达RV3136基因对耻垢分枝杆菌生长速率无显著影响42
• 4.11 过表达RV3136基因增强耻垢分枝杆菌在低PH环境下的存活能力42-43
• 4.12 过表达RV3136基因增强了耻垢分枝杆菌对表面压力（SDS）的耐受43-44
• 4.13 过表达RV3136基因增强耻垢分枝杆菌对H2O2的耐受44
• 4.14 过表达RV3136基因增强耻垢分枝杆菌对联胺的耐受44-45
• 4.15 过表达RV3136基因增强耻垢分枝杆菌对异烟肼和万古霉素的耐受45-46
• 4.16 过表达RV3136基因降低了耻垢分枝杆菌细胞壁的渗透性46-47
• 4.17 过表达RV3136基因利于耻垢分枝杆菌在THP-1 中存活47
• 4.18 过表达RV3136基因对巨噬细胞内细胞因子没有明显改变47-48
• 4.19 RV3136基因可能通过影响胞壁相关基因的转录而改变细胞壁重塑48-50
• 第5章 结论与展望50-53
• 5.1 结论与分析50-51
• 5.2 展望51-53
• 参考文献53-59
• 致谢59-61
• 在学期间发表的文章61

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1 徐苗,陈保文,沈小兵,苏城,罗永艾,王国治;耻垢分枝杆菌作为免疫调节剂的研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年09期

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本文编号：1076795