GlnRS与ArgRS多抗的制备及表达分析

发布时间：2017-11-01 16:12

  本文关键词：GlnRS与ArgRS多抗的制备及表达分析

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【摘要】：氨酰-tRNA合成酶(AARS)为一类蛋白合成的关键酶,将特定的氨基酸链接到对应的tRNA上。它除了具有经典的催化功能外还具有调节基因转录、促进细胞转移、DNA损伤修复、抑制血管生成、诱导细胞凋亡等非经典功能。谷氨酰胺-tRNA合成酶(GlnRS)和精氨酸-tRNA合成酶(ArgRS)是AARS成员之一,除了经典的催化功能外,还具有多种非经典功能,与诸多疾病存在密切的联系。研究GlnRS和ArgRS的结构和功能可为揭示相关的疾病机制提供理论依据。目的:本实验的目的就是制备GlnRS和ArgRS抗体,并研究它们在不同细胞的表达情况,为下一步其功能的深入研究奠定基础。方法:1.GlnRS和ArgRS多抗的制备及检测运用生物信息学的方法对GlnRS和ArgRS进行分析确定抗原部位。通过PCR获取编码抗原片段的目的基因,将其插入PET28a构建表达载体。将重组子转化表达菌BL21,经IPTG诱导表达重组蛋白,并用镍柱进行纯化。以制备的重组蛋白为抗原,背部皮下注射小鼠制备多抗,并用western blot法检测其特异性。2.GlnRS和ArgRS在不同细胞的表达分析以制备的抗体为一抗,western blot检测不同细胞GlnRS和ArgRS的表达并进行分析。结果:1.GlnRS和ArgRS多抗的制备及检测经过生物信息学分析,我们确定GlnRS N端236个氨基酸(N(1-236)-GlnRS)为制备GlnRS抗体的抗原,ArgRS N端72个氨基酸(N(1-72)-ArgRS)为制备ArgRS抗体的抗原。PCR获得了目的基因N(1-236)-GlnRS和N(1-72)-ArgRS,并成功构建了表达载体PET28a-N-GlnRS和PET28a-N-ArgRS。重组蛋白N-GlnRS和N-ArgRS获得表达与纯化。成功制备了GlnRS和ArgRS抗体,且特异性较好。2.GlnRS和ArgRS在不同细胞的表达分析在GlnRS和ArgRS表达分析中,GlnRS在HeLa细胞高表达,在肿瘤细胞HepG2和正常细胞LO2中表达没有显著差异。GlnRS的表达量在Eμ-Myc高表达的B淋巴瘤细胞比在正常B淋巴细胞要高,并且恶性程度越高表达量越高。ArgRS在肿瘤细胞HepG2的表达量比在正常细胞LO2高,但在HeLa细胞表达量没有明显增加。结论:1.成功制备GlnRS与ArgRS抗体,且特异性较好,为下一步GlnRS和ArgRS在蛋白水平的研究奠定基础。2.GlnRS和ArgRS的表达随肿瘤细胞恶性程度和肿瘤发生的机制不同而有差异,GlnRS和ArgRS的表达并不是在所有肿瘤细胞中都比正常细胞表达量增高。
【关键词】：GlnRS ArgRS 多抗制备 表达分析
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 第一章 文献综述9-23
• 1. 氨酰-tRNA合成酶9-17
• 2. 多酶复合体结构17-19
• 3. 谷氨酰胺-tRNA合成酶19-20
• 4. 精氨酸-tRNA合成酶20-21
• 5. 研究内容与意义21-23
• 第二章 材料与方法23-41
• 1. 实验材料23-27
• 2. 常用仪器设备27-28
• 3. 常用方法28-41
• 第三章 人GlnRS多抗的制备与表达分析41-55
• 1. 材料与方法41-42
• 2. 结果与分析42-53
• 3. 讨论53-55
• 第四章 人ArgRS多抗的制备与表达分析55-66
• 1. 材料与方法55-56
• 2. 结果与分析56-64
• 3. 讨论64-66
• 第五章 总结与展望66-68
• 1. 已取得的成果66
• 2. 有待进一步的探究66-67
• 3. 研究展望67-68
• 参考文献68-75
• 研究生期间的科研成果75-76
• 附录76-78
• 致谢78-79

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