显微捕获联合低体积扩增细胞标识与法医应用的研究

发布时间：2015-01-18 10:08

 

【摘要】 目的:显微捕获联合低体积扩增(Low volume polymerase chain reaction,LVPCR)技术进行细胞分离检验为法医混合微量生物检材的检验提供了有效途径,但法医实践检案的检材细胞质量良莠不齐,又含杂质干扰等,致使镜下目的细胞的辨识成为检验结果好坏的关键环节之一。本研究基于显微捕获仪平台,应用组织学染色的原理,初步建立一种适用于显微捕获联合LVPCR的细胞标识方法,并评价在法医实际应用的效果。方法:取10名志愿者的口腔拭子及2个案例检材为样本,制作细胞悬液;配制0.05g/ml龙胆紫及2.5×10-4 g/ml亚甲基蓝染液。通过浓度梯度及时间梯度染色,分别建立并优化以龙胆紫、苏木素、亚甲基蓝为标识物的细胞悬液单染法;基于显微捕获仪平台,分别对等量染色的口腔上皮细胞进行分离检验,比较3种染色法及染色时间对显微捕获联合LVPCR技术检测结果的影响,优化细胞标识物;应用3者中较优的染色法对志愿者口腔上皮细胞悬液染色,捕获不同样本等量染色及未染色细胞分离检验,并对同一样本重复该操作20次,比较2种条件下检测结果成功分型率的差异,评价该染色法在显微捕获联合LVPCR技术中的适用性;应用于案例检材的细胞分离检验,初步研究所建细胞标识法的应用效果。结果:室温条件下,100μl细胞悬液加入0.5μl 0.05g/ml龙胆紫染液,染色5min,胞核呈紫红色,与胞浆对比明显,染色效果不随染色时间(≤60min)延长而明显变化。优化后的3种细胞悬液单染法均能对口腔上皮细胞胞核清晰标识,但龙胆紫染色细胞的分离检验的成功分型率及有效分型率均高于另外两种染色法,且染色时间(≤60min)对DNA检测结果无明显影响;而与未染色等量细胞分离检验结果比较,不同样本及同一样本多次重复试验结果的成功分型率无明显差异(p>0.05)。案例检材应用,目的细胞标识清楚,较未染色时易于辨识,捕获到更多目的细胞,多次分离检验结果叠加复合达同一认定标准。结论:龙胆紫细胞悬液单染法适用于显微捕获联合LVPCR技术,有助于提高该项技术中显微捕获仪平台的检测效能,并利于在法医实践检案中应用与推广。

前  言

针对犯罪现场提取的乳头擦拭物、精斑等混合疑难检材中犯罪嫌疑人细胞的分离检验，除免疫磁珠分离技术（精子）、流式细胞仪分离技术[1-2]等方法的研究外，国内外法医学学者研究较多也较为成熟的属显微捕获分离技术[3-5]。主要包括两个技术平台：1.显微捕获仪平台；该平台目前主要处理乳头擦拭物，通过镜下有核口腔上皮细胞（来源于犯罪嫌疑人）和无核角化上皮细胞碎片（来源于受害者皮肤）的辨识，捕获目的细胞进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等DNA检验，以获取犯罪嫌疑人的单一 STR 分型，进行同一认定；2.激光捕获显微切割（Laser capture microdissection，LCM）系统；此平台目前主要处理女性成分较多、差异裂解法无法消除女性成分干扰的混合精斑，通过镜下发现并捕获精子进行PCR 等 DNA 检验。然而，疑难案件检材中可捕获到的目的细胞数量很少，属低拷贝模板（Low copy number ，LCN），采用常规 PCR 操作，难于获得有效的 STR分型结果[6]。因此，我国公安部物证鉴定中心胡兰学者的研究小组采用并优化低体积扩增技术，利用其高灵敏度[7-8]，降低对目的细胞数量的要求，从而建立了显微捕获联合LVPCR技术[9]。
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1 材料、仪器与方法

1.1 材料与仪器
口腔拭子                            自制
烟蒂                                案件现场提取
乳头擦拭物                          案件现场提取
龙胆紫染液                          自制
亚甲基蓝染液                        自制
苏木素染液                          北京冬歌生物科技有限公司
灭菌去离子水                        自制
AG480F AmpliGrid  微量反应玻片        奥斯邦有限公司
Φ80μm毛细管玻璃吸针               德国艾本德有限公司
Identifier 试剂盒                       美国应用生物系统公司
Olympus 倒置显微镜                   日本株式会社
显微操作仪                          德国 TransferMan NK2 型                

ASC200D AmpliSpeed 热循环仪          奥斯邦有限公司
遗传分析仪                          美国应用生物系统公司 3130XL型

1.2 细胞悬液制备及染液配制
口腔拭子：来源于10名志愿者，分别置于1.5ml 离心管中，加 1ml 灭菌去离子水，振荡至液体悬浊，弃载体混匀，制成口腔上皮细胞悬液备用。烟蒂：剪取过滤嘴末端1cm×1cm纸质部于1.5ml 离心管中，加1ml 灭菌去离子水，37℃孵育1h，期间涡旋振荡数次；8 000r/min 套管离心 3min，弃载体及上清，留沉渣约 30μl，加180μl 灭菌去离子水，混匀备用。乳头擦拭物：剪取棉签表层棉团于 1.5ml 离心管中，后续处理同烟蒂，制备脱落细胞悬液备用。 称取5g龙胆紫晶体于消毒磨口烧瓶中，加90ml 灭菌去离子水及10ml 95%乙醇，搅拌至完全溶解，配制成0.05g/ml 龙胆紫染液[14]；称取0.025 g亚甲基蓝粉末于消毒磨口烧瓶中，加100 ml 无菌去离子水，振荡至完全溶解，配制成2.5×10-4 g/ml 亚甲基蓝染液[15]。苏木素染液为购买的成品。 

论文正文：显微捕获联合低体积扩增细胞标识与法医应用研究..............................7

前  言..................................7

1  材料、仪器与方法........................ 9

2  结果 ......................................11

3  讨论 ..................................... 22

结  论....................................25

3讨论

3.1 细胞标识法的建立和优化
为尽量减少细胞标识方法带入的物质对LVPCR的影响，根据碱性染料电离时产生的有色阳离子可与染色质（体）内酸性物质脱氧核糖核酸（带负电荷），通过电荷间引力作用牢固结合，使胞核着色的原理[10]，选用 3 种常用碱性染料，通过染色浓度、时间的优化，分别建立了龙胆紫、苏木素及亚甲基蓝细胞悬液单染法；镜下观察，3种方法的染色效果均达到细胞核标记清晰、目的细胞易于辨识的要求。 鉴于5个新鲜口腔上皮细胞的分离检验，目前已能较稳定获得成功分型结果，而除龙胆紫以外的另 2 种染液的引入，均导致成功分型率的明显下降，提示苏木素、亚甲基蓝对 LVPCR 有抑制作用，不适合在显微捕获联合 LVPCR 中应用；因此，龙胆紫细胞悬液单染法（室温，加0.5μl 0.05g/ml 龙胆紫染液于 100μl 细胞悬液，混匀静置 5min，即镜下观察捕获细胞）是 1 种可用于显微捕获联合 LVPCR技术的细胞标识法。

3.2 龙胆紫细胞悬液单染法的适用性
前期对显微捕获联合LVPCR的研究发现： 3个新鲜口腔上皮细胞的检测即可较稳定的获得13个位点以上的正确STR分型，其中部分检测结果会出现非特异性扩增、等位基因丢失等现象，这主要源于模板量极其微小，而LVPCR检测方法的高灵敏也增加了随机效应的发生，例如：图谱中出现无关等位基因或伪等位基因；杂合子等位基因不平衡扩增，极度峰高不平衡导致等位基因丢失，将杂合子误判为纯合子等[19-20]。同时，，由于案例检材中目的细胞数目极少，又受LVPCR技术的反应体积限制及精细操作中难以避免的扩增失败影响，所以不能将所有细胞集中进行扩增。鉴于 3 个细胞的检验效果已满足图谱叠加的要求，可通过复合获得完整STR分型，达到同一认定目的，所以实践检案中多采用3个细胞1组进行LVPCR及DNA检测。 本研究以不同样本及同一样本的 3 个口腔上皮细胞为模板，在染色及未染色条件下，进行比对实验，结果示所有模板均获得13个位点以上正确STR分型，虽然 2 种条件下各有部分图谱出现非特异性扩增及等位基因丢失，但成功分型率无明显差异（P>0.05）。提示龙胆紫细胞悬液单染法的引入，并不加重更微量模板LVPCR 中非特异性扩增、等位基因丢失现象，所得 DNA 检验图谱亦可通过叠加复合，达到同一认定标准。
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结   论

龙胆紫细胞悬液单染法是一种适用于显微捕获联合LVPCR技术的细胞标识方法，可一定程度降低目的细胞辨识难度，有助于提高该项技术中显微捕获仪平台在法医实践检案中的应用效能，利于其推广应用。 
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参考文献：

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[2] 黄江平,李彩霞,亓冰,任文彦,胡兰.  显微捕获技术结合低体积扩增技术在混合唾液斑检验中的应用[J]. 吉林公安高等专科学校学报. 2010(01)
[3] 赵晓曦,其木格,梁琳,武艾宁.  荧光原位杂交技术与羊水染色体核型分析在产前诊断中的作用和意义[J]. 中国优生与遗传杂志. 2009(12)
[4] 朱珊珊,凌奕,许琳,麦扬青,王梅红,陈雪银,黄元华,黎明红.  国产荧光原位杂交探针在产前染色体异常诊断中的应用研究[J]. 海南医学院学报. 2009(09)
[5] 霍塞虎,吕云平.  低拷贝模板DNA分析技术研究进展[J]. 中国法医学杂志. 2009(04)
[6] 赵一梅,郑梅玲,化爱玲,张月莲,张桂林,贺江梅.  荧光原位杂交技术在检测胎儿染色体数目异常中的应用[J]. 中国优生与遗传杂志. 2009(07)
[7] 干志峰,方小武,吴日然,梁少霞,王德刚.  荧光原位杂交技术在染色体非整倍体产前诊断中的应用研究[J]. 中国优生与遗传杂志. 2009(06)
[8] 卢建,章钧,何蕴韶.  荧光原位杂交技术及其临床应用[J]. 分子诊断与治疗杂志. 2009(01)
[9] 杜军,周晓军.  荧光原位杂交技术在实体瘤诊断中的应用[J]. 医学研究生学报. 2009(02)
[10] 韩哲辉,岳天孚,张颖.  荧光原位杂交技术在产前诊断中的应用[J]. 国际生殖健康/计划生育杂志. 2009(01)



本文编号：11665