Cas9介导的线粒体tRNA核修饰基因gtpbp3,mto1和trmu的斑马鱼突变体构建

发布时间：2017-11-21 20:24

  本文关键词：Cas9介导的线粒体tRNA核修饰基因gtpbp3,mto1和trmu的斑马鱼突变体构建

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【摘要】：在人类细胞中,GTPBP3, MTO1和TRMU是由核基因编码的,但进入线粒体发挥功能的3种具有酶活性的蛋白,他们共同参与线粒体tRNAs U34位点的5-牛磺酸甲基-2-硫尿嘧啶(τm5S2U)修饰。其中GTPBP3和MTO1以形成a2β2异源四聚体的方式共同参与线粒体tRNALeu(UUR)和tRNATrp U34位点的5-牛磺酸甲基尿嘧啶(τm5U)修饰；TRMU从另外的一条路径与GTPBP3, MTO1一起但又独立的完成线粒体tRNALys, tRNAG1u和tRNAGlnU34位点的τm5S2U修饰。已有报道证明：GTPBP3, MTO1和TRMU的突变在人体中可导致相关的线粒体疾病的发生(GTPBP3突变可导致肥厚性心肌病、乳酸酸中毒和脑病,MTO1突变可导致肥厚性心肌病和乳酸酸中毒,TRMU突变可导致急性的婴儿肝功能衰竭)。并且,最近在人类细胞中的研究表明：除了线粒体tRNA的修饰功能外,MTO1有可能会参与线粒体核糖体蛋白的组装过程；TRMU可能参与富含铁-硫簇的酶复合体(如呼吸链复合体Ⅱ)的组装。为了在模式生物中更好的揭示3基因突变导致的相关线粒体疾病的致病机理以及组织特异性发病机制,我们在斑马鱼中对gtpbp3, mtol和trmu进行了生物信息学以及时空表达谱分析,并且利用CRISPR/Cas9技术构建了3基因的突变体。物种间同源比对分析显示：三种蛋白的氨基酸序列在多种物种间均是相对保守的,其中在斑马鱼和人类之间的同源性均在60%以上。而且三种蛋白中的很多重要功能域在不同物种间也是高度同源保守的。qRT-PCR显示gtpbp3, mtol和trmu基因在成鱼各种器官中广泛表达,在卵巢里含量尤其多；在新陈代谢旺盛的组织表达量也较高,比如眼睛、心脏、肾脏等。对gtpbp3的进一步研究发现,在未受精的卵子中可以检测到其高度的mRNA和蛋白水平,而且该基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中均有表达。这些结果显示三基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中可能发挥着重要功能,而且对于成鱼中那些ATP需求量较高的组织是相对重要的。利用CRISPR/Cas9技术,我们得到了gtpbp3基因的gtpbp3△14bp和gtpbp3△13bp两种突变体类型；mto1基因的mto1△7bp和mto1△8bp两种突变体类型以及trmu基因的trmu+32bp一种突变体类型。除gtpbp3△14bp之外,其他的突变类型均会导致相应基因的移码突变和提前终止突变,从而成功的实现了三基因的敲除。因此,我们在斑马鱼中成功的构建了gtpbp3,mto1和trmu基因的突变体,这将有利于后续的对于3基因功能及突变导致的相关疾病致病机理的深入研究。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363;Q78

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本文编号：1212181