结核分枝杆菌PPE44蛋白在胁迫应答和病原菌—宿主相互作用中的功能研究

发布时间：2017-11-27 12:19

  本文关键词：结核分枝杆菌PPE44蛋白在胁迫应答和病原菌—宿主相互作用中的功能研究

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【摘要】：结核分枝杆菌感染引起的结核病仍然是威胁人类健康甚至是生命的重要传染病。全世界约有三分之一的人口被感染,每年有900万新增病例和150万死亡病例。结核分枝杆菌被认为是最成功、分布最广泛的胞内致病菌之一,通过呼吸进行传播,从而有效的建立肺部感染。尽管预防疫苗以及用于治疗结核病的抗结核菌药物不断出现,但是由于耐药(包括多耐药、广泛耐药甚至完全耐药)菌株以及与HIV共感染的出现,亟待深入探索结核杆菌的致病性并在此基础上开发新的疫苗或新的治疗药物。结核杆菌由呼吸道进入肺泡后会面临来自宿主的多种不利环境。肺泡巨噬细胞被认为是结核杆菌感染早期阶段的主要效应细胞,组成免疫防御的第一道防线。一旦结核杆菌通过小飞沫进入肺泡,会被肺泡巨噬细胞内化进入吞噬体(phagosome),吞噬体先后与晚期内吞体(endosome)及溶酶体(lysosome)融合形成吞噬溶酶体。吞噬溶酶体获得能酸化吞噬室至pH 5的分子标记,水解酶才能发挥作用。吞噬溶酶体内最终形成一个对入侵结核杆菌的杀菌环境:酸性条件、活性氧中间体(ROI)、活性氮中间体(RNI)及营养匮乏等,从而限制细菌的生存和增殖。除此之外,结核杆菌在传播过程中还会遭受到紫外的照射,失水,以及低温等多种压力。结核分枝杆菌已经形成了许多策略来逃避巨噬细胞的破坏作用,从而在这些不利环境中生存及与宿主细胞共存并最终导致疾病,同时这也依赖于多种基因的复杂的表达调控网络。结核分枝杆菌PPE家族基因因其在结核分枝杆菌与宿主间的相互作用中发挥重要的功能而越来越被重视。该家族基因主要参与结核分枝杆菌的毒力,作为抗原变异和免疫逃逸机制的来源等发挥作用。PPE家族的许多基因受到Sigma因子的调控,而Sigma因子在细菌压力反应中发挥了重要的作用。Sigma缺失菌株对sds诱导的表面活性压力、氧化压力以及热休克等均表现得更加敏感。我们推测rv2770c(ppe44)也可能受到sigma因子的调控,可能也会在应对这些压力环境中发挥一定的作用。结核杆菌能分泌毒力蛋白,这些毒力蛋白能为它们争取更有利的生存环境。mrna差异显示(dd)数据表明rv2770c(ppe44)极有可能是一个毒力蛋白,其毒性从不同角度得到验证:(1)在减毒的结核杆菌h37ra菌株中下调表达;(2)在临床菌株中的表达表现出明显差异,结核杆菌北京菌株中的表达明显高于其他非北京菌株,只存在于致病性分枝杆菌中;(3)感染豚鼠90天后其表达显著上调。牛分杆杆菌bcg或结核分枝杆菌感染小鼠后能引起ppe44特异性的体液和细胞免疫应答,最重要的是与bcg(卡介疫苗)相比,结核分枝杆菌感染的小鼠用以ppe44为基础的亚单位疫苗来接种可以获得保护作用,因此我们推断ppe44可能在操纵宿主的免疫应答过程中起重要作用。此外,ppe44在压力条件下上调表达。尽管现已对部分ppe家族成员进行了深入研究,但家族中大多数成员的功能未知。为了研究rv2770c是否在宿主-病原菌互作及应对环境压力中发挥作用,我们以结核分枝杆菌h37rv基因组为模板,对rv2770c(ppe44)基因进行了克隆,并将其与带有myc标签的穿梭质粒pnit连接,获得pnit-rv2770c重组质粒后电转到生长速度较快且无毒力的耻垢分枝杆菌mc2155菌株中,成功构建了表达rv2770c重组蛋白的重组耻垢分枝杆菌。通过亚细胞分级分离实验,应用westernblotting技术检测了目的蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的定位。为了研究rv2770c蛋白的过表达是否会对耻垢分枝杆菌的生长产生影响,我们检测了表达rv2770c的重组菌与只含有pnit的空载对照菌的生长曲线。为了解rv2770c蛋白是否与结核分枝杆菌在多种环境压力下的存活相关,我们检测了表达rv2770c的重组菌以及空载菌在酸性条件、sds引起的表面活性压力、h2o2和联胺诱导的氧化压力及酸性nano2等体外环境压力下的生长情况,同时检测了rv2770c过表达菌株在巨噬细胞内的存活情况以及对巨噬细胞的影响。通过本研究,我们发现rv2770c蛋白定位在细胞表面,能改变耻垢分枝杆菌的菌落形态,但对生物膜形成及滑动能力没有影响。rv2770c过表达增强了耻垢分枝杆菌对酸性ph、表面活性压力以及氧化压力等多种环境压力的耐受。表达rv2770c蛋白的重组菌在侵染巨噬细胞过程中,促进宿主细胞死亡,有利于自身存活。实时荧光定量rt-pcr结果显示,ms_rv2770c刺激巨噬细胞产生促炎性因子il-6和il-12p40的能力明显高于ms_pnit。通过信号通路抑制剂实验,我们发现rv2770c通过nf-κb、erk1/2和p38信号途径诱导il-6的分泌,但只有nf-κb信号通路是rv2770c诱导il-12p40分泌所必需的,这说明rv2770c刺激两种细胞因子分泌的信号途径可能存在差异。这些结果揭示了rv2770c可能通过干扰宿主的信号通路来操纵宿主的免疫应答。本研究为进一步探索结核分枝杆菌Rv2770c(PPE44)基因的免疫学功能及免疫逃避机制奠定了基础。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.911

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1 周明亮;结核分枝杆菌PPE44蛋白在胁迫应答和病原菌—宿主相互作用中的功能研究[D];西南大学;2016年

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