刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶基因的克隆及原核表达

发布时间：2017-12-16 20:30

  本文关键词：刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶基因的克隆及原核表达

  更多相关文章： 刚地弓形虫 蛋白质二硫键异构酶 克隆 原核表达 免疫反应性

【摘要】：目的克隆刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶(TgPDI)基因,原核表达、纯化重组TgPDI蛋白,并分析其免疫反应性。方法制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgPDI基因全长编码序列(登录号为AJ306291.2)的开放阅读框设计合成引物,并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经双酶切后连接入pET-30a(+)载体,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切并测序鉴定。将重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3),并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗His抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白及其免疫反应性;重组蛋白His-TgPDI通过Ni2+琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化,纯化蛋白经SDSPAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度。结果 RT-PCR扩增产物约为1 427 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得约57 kDa的可溶性重组蛋白。Western blotting结果表明,诱导表达的重组蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。亲和纯化后获得纯度大于95%的重组TgPDI蛋白质。结论克隆得到弓形虫PDI基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白,且该重组蛋白具有免疫反应性。
【作者单位】： 山西医科大学寄生虫学教研室;太原师范学院生物系;山西医科大学生理学系;
【基金】：国家自然科学基金(81071374) 山西医科大学科技创新基金(01201103) 山西医科大学基础学院331科技启动基金(201202)
【分类号】：R382.5
【正文快照】： 刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫,可感染人类和其他温血动物[1]。弓形虫速殖子侵入宿主细胞后不断分裂、增殖,继而破坏宿主细胞,而蛋白质的正确构象对于速殖子的侵袭至关重要。弓形虫蛋白质二硫键异构酶(PDI)是本实验室应用双向电泳结合质谱技术从可溶

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陈凌;郭盛;郝春莉;吴良霞;张建华;;重组小鼠白细胞介素-17F/His融合蛋白的原核表达、纯化及生物活性[J];中国生物制品学杂志;2010年07期

2 王海龙;殷丽天;孟晓丽;申金雁;刘红丽;殷国荣;;刚地弓形虫棒状体蛋白17基因的克隆、表达及抗原性分析(英文)[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2012年01期

3 刘转转;杨燕萍;殷国荣;王海龙;李雅清;祝建疆;刘宜升;;刚地弓形虫苹果酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫原性分析[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2013年01期

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 庞敏;杜永成;蒋毅;刘志宏;张彩苹;陈丽丽;王海龙;;大鼠Clara细胞分泌蛋白CC16基因的克隆和原核表达及纯化[J];环境与健康杂志;2013年04期

2 王海龙;殷丽天;孟晓丽;张铁娥;关丽;刘红丽;殷国荣;;刚地弓形虫活化蛋白激酶C受体1基因的克隆和原核表达及纯化和抗原性分析[J];环境与健康杂志;2013年07期

3 郭盛;张建华;吴良霞;陈凌;郝春莉;范小勇;;重组IL-17A耻垢分枝杆菌的构建及其对巨噬细胞表达炎症因子的影响[J];中国生物制品学杂志;2012年11期

4 祖力皮也·吐尔逊;德力夏提·依米提;曹春宝;马海梅;李玉娇;周晓涛;朱明;马秀敏;温浩;丁剑冰;;细粒棘球绦虫重组BCG-EgG1Y162菌株的构建和表达[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2013年02期

5 李润花;郝海霞;王海龙;孟晓丽;申金雁;殷国荣;;刚地弓形虫肌动蛋白基因的克隆与表达[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2013年05期

6 吕志力;彭涛;李勇;;葡萄糖调节蛋白58在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义[J];诊断学理论与实践;2013年04期

7 魏海霞;李雪兰;张浩;彭鸿娟;;孕妇弓形虫感染相关诱因的Meta分析[J];中国人兽共患病学报;2013年12期

8 刘晓龙;王越;干小仙;;免疫蛋白质组学技术在寄生虫病诊断抗原筛选中的应用[J];中国人兽共患病学报;2013年12期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 周琳t，

本文编号：1297381