基于烟雾暴露诱导弹性蛋白参与自身免疫反应的慢阻肺动物模型的构建及其机制研究

发布时间：2017-12-29 05:04

本文关键词：基于烟雾暴露诱导弹性蛋白参与自身免疫反应的慢阻肺动物模型的构建及其机制研究　出处：《浙江大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种常见的慢性气道炎症性疾病,其主要表现为持续的气道炎症和粘液高分泌,不完全可逆的气流受限和气道重构等特征。烟雾暴露是慢阻肺最重要的危险因素之一,但目前烟雾暴露诱发慢阻肺气道炎症的分子机制并不明确,且临床上对慢阻肺仍缺乏有效的预防和治疗手段,而缺乏一种成熟的、统一的慢阻肺动物模型则成为主要的限制因素之一。肺内弹性蛋白(elastin,Eln)是一种由高度交联的赖氨酸残基缩合所形成的不溶性蛋白质,其水溶性的前体(tropoelastin)可以被中性粒细胞和巨噬细胞分泌的弹性蛋白酶降解成可溶性的弹性蛋白多肽片段。越来越多的研究表明,在慢阻肺患者和吸烟者中均可检测到弹性蛋白的降解片段,且检测elastin特有片段,即交联的锁链素和异锁链素也已成为慢阻肺诊断的生物学指标之一。故而越来越多的研究者提出elastin可能作为一种自体抗原(self-antigen),通过抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)提呈而介导了慢阻肺气道炎症的自免疫反应。然而,目前还几乎没有任何动物实验数据证明elastin在吸烟诱导的慢阻肺气道炎症中的关键作用。慢阻肺的炎症与免疫机制非常复杂,目前已有的研究表明,香烟烟雾暴露可先后激活体内的固有免疫和适应性免疫系统,而适应性免疫主要依赖于T细胞的作用。在肺局部的淋巴结内,抗原提呈细胞(包括肺泡巨噬细胞和树突状细胞)将摄取的抗原递呈给相应的T细胞,使其活化,增殖并发生分化,最终形成效应性T细胞。而效应性T细胞主要包括细胞毒性T细胞(CD8+)和辅助性T细胞(CD4+),已有的临床研究结果显示Tc1与Th17细胞与慢阻肺的关系较为密切,也有动物实验的结果证实Th1及Th17细胞在吸烟诱导的肺部炎症中起重要作用。但是,这些亚型的T细胞是否参与慢阻肺的自身免疫及其具体的作用机制目前仍没有明确的研究与解释。为了研究上述问题,我们首次在e1astin作为慢阻肺自身抗原的理论基础上,成功构建了香烟烟雾暴露联合elastin短期给药的CE-急性炎症模型,及香烟烟雾暴露联合elastin长期给药的CE-慢性肺气肿模型。而在上述模型的基础上,我们利用体内实验与体外实验相结合的方法,分别研究了香烟烟雾暴露、elastin,肺内巨噬细胞、APC及Th1,Th17细胞在慢阻肺自免疫过程中的作用及机制。第一部分香烟烟雾暴露联合弹性蛋白诱导的新型慢阻肺小鼠动物模型的建立目的:利用慢阻肺发病机制中elastin作为自身抗原的自免疫机制,联合香烟烟雾暴露,构建一种新型的,快捷高效的符合人慢阻肺发病机制及疾病特点的小鼠慢阻肺动物模型。方法:在急性炎症模型中,将C57BL/6小鼠(雄性,6-8周,8-10只/组)按体重随机分为4组,即Air+NS组(对照组),Air+Eln组(单纯elastin给药组),CS+NS(单纯CS暴露组)及CS + Eln组(模型组)。CS+NS及CS+Eln组给予香烟烟雾暴露(周100支/天,5天/周,共2周),间隔2周后,Air+Eln组及CS+Eln组给予气道滴注Eln(elastin,50ug/只/次)。末次给药24h后处理小鼠,收集标本。一部分小鼠左肺先进行支气管细胞灌洗(BALF),行白细胞总数及分类细胞的计数,然后灌注4%多聚甲醛内固定,制成病理切片观察炎症浸润和气道粘液分泌。小鼠右肺用于提取mRNA和蛋白,用荧光定量PCR或ELISA法检测相关分子的表达和分泌。另外一部分小鼠无菌条件下行PBS血流灌注后取双肺,经胶原酶消化及滤膜过滤后制备成单个核细胞悬液,经体外刺激后以流式检测肺组织中各个T细胞亚型的变化。在慢性肺气肿模型中,将C57/6小鼠(雄性,6-8周,8-10只/组)按体重随机分为2组,即Air+NS组(对照组),CS+Eln组(模型组)。香烟烟雾暴露过程同急性模型,间隔2周后,CS+Eln组(模型组)组间隔一天给予气道滴注Eln(elastin,弹性蛋白,50ug/只/次)达1个月(共15次)。末次给药24h后处理小鼠,收集标本。模型小鼠每2周检测体重,一部分小鼠左肺先进行支气管细胞灌洗液(BALF),行白细胞总数及分类细胞的计数,然后灌注4%多聚甲醛内固定,制成病理切片观察气道粘液分泌、小气道胶原沉积及肺泡内衬间隔。右肺提取蛋白,Western Blot检测细胞凋亡及细胞核坏死相关蛋白的表达。一部分小鼠在浅麻醉下用BUXCO-DFS仪器行肺功能检测。结果:香烟烟雾暴露联合elastin短期给药可明显诱导小鼠气道炎症及粘液高表达,且其BALF上清中Th1,Th17相关的前炎症因子(IL-6)和趋化因子(CXCL1,CXCL2)的表达较对照组及单纯熏烟组或单纯elastin给药组均有明显升高,而Th2相关的炎症因子(IL-4,IL-13)表达则无明显差异。其肺组织中IFN-y和IL-17A蛋白的表达明显升高,且全肺流式细胞检测发现其T细胞亚型中以Th17增加最为明显。而我们的研究还发现虽然elastin联合弗氏佐剂致敏,再给予elastin短期给药也可诱导一定的气道炎症细胞浸润及炎症因子和趋化因子的表达升高,但是其升高水平均不如CE急性模型,且其肺组织中T细胞亚群的增加以Th1为主。我们还同时尝试了 elastin(腹膜腔致敏)+elastin(短期气道给药)模型和熏烟(CS)+熏烟(CS)模型,发现这2种模型均不能诱导气道炎症。这些结果说明,CE-急性模型才是最符合慢阻肺急性炎症特点的模型。继而我们用香烟烟雾暴露联合elastin长期给药的方法尝试构建了 CE-肺气肿模型,发现在该模型构建过程中,模型组小鼠体重虽然也一直都有所增加,但是从造模第4周开始模型组小鼠体重明显轻于对照组小鼠体重,一直到模型结束。且模型组在诱导气道炎症的同时,亦可诱导气道粘液的高表达,小气道周围胶原沉积。肺功能检测结果显示,模型组小鼠FEV20(ml,Forced expiratory volume in 20ms,20ms用力呼气量相,当于人肺功能的FEV1指标)及FEV20/FVC(%,Forced expiratory volume in 20ms/Forced vital volume,20ms 用力呼气量相/用力肺活量,相当于人的FEV1/FVC)较对照组明显降低。模型组小鼠肺泡内衬间隔增加,说明存在肺气肿病理表型。同时,WB检测肺组织细胞凋亡(Caspase-3,Caspase-9)及细胞核凋亡(RIP,RIP3)相关蛋白表达均明显增加。这些结果说明,香烟烟雾暴露联合elastin长期给药的方法可以成功诱导肺气肿产生,且细胞凋亡及细胞核死亡都参与了该过程的发生与发展。结论:香烟烟雾暴露联合elastin短期(3天)给药可成功模拟人慢阻肺急性炎症的特点,从而构建小鼠慢阻肺急性炎症模型,而香烟烟雾暴露联合elastin长期(30天)给药可成功模拟人慢阻肺肺气肿的特点,从而构建小鼠慢阻肺肺气肿模型。与既往的慢阻肺动物模型相比,我们的CE模型气道炎症更明显(中性粒细胞比例高),气道粘液高表达,具有Th1/Th17细胞免疫反应,气道重构,肺功能下降,肺气肿增加等特点,且造模时间更短,操作简便,易于统一及重复。第二部分香烟烟雾暴露联合弹性蛋白诱导的慢阻肺动物模型自身免疫机制研究目的:通过我们前期构建的慢阻肺动物模型,研究香烟烟雾暴露,elastin,肺泡巨噬细胞及肺APC细胞等在慢阻肺自身免疫发生发展过程中的具体作用及机制。方法:将C57/6小鼠(雄性,6-8周,8-10只/组)按体重随机分为2组,CS组(香烟烟雾暴露组)和Air组(空气对照组)。CS组按前述方法给予香烟烟雾暴露2周。末次暴露24h后处理小鼠,收集标本。一部分小鼠全肺行支气管肺泡灌洗(BALF),BALF细胞提取mRNA及蛋白,荧光定量PCR及WB检测MMP-12的表达。一部分小鼠BALF上清丙酮沉淀蛋白后,及肺组织提取蛋白后,WB检测elastin的表达。一部分小鼠全肺APC(磁珠分选)细胞与脾脏CD4+T细胞(磁珠分选)共培养,给予elastin体外刺激3天后,流式细胞术检测Th细胞亚群的分化。为了进一步验证elastin在CE模型中的重要作用,我们在构建CE-急性模型的同时,增加了 CS+BA4组(BA4为elastin中和抗体,每天熏烟前给予10ug/只/次的BA4气道给药)。一部分小鼠左肺先进行支气管细胞灌洗液(BALF),行白细胞总数及分类细胞的计数,然后灌注4%多聚甲醛内固定,制成病理切片观察炎症浸润和气道粘液分泌。小鼠右肺用于提取mRNA和蛋白,用定量荧光PCR或ELISA法检测相关分子的表达和分泌。一部分小鼠全肺APC(磁珠分选)细胞与脾脏CD4+T细胞(磁珠分选)共培养,给予elastin体外刺激3天后,流式细胞术检测TTh细胞亚群的分化。为了进一步验证Th17在CE模型中的重要作用,我们用IL-17A敲除小鼠及其同窝对照构建了 CE-急性模型。小鼠左肺先进行支气管细胞灌洗液(BALF),行白细胞总数及分类细胞的计数,然后灌注4%多聚甲醛内固定,制成病理切片观察炎症浸润和气道粘液分泌。小鼠右肺用于提取mRNA和蛋白,用定量荧光PCR或ELISA法检测相关分子的表达和分泌。结果:我们发现熏烟2周小鼠BALF细胞中巨噬细胞特异性分泌的基质金属蛋白酶MMP-12的mRNA及蛋白水平的表达较对照组有显著升高。这说明短期的香烟烟雾暴露可以激活肺泡巨噬细胞,从而使肺部MMP-12的分泌增加。而我们同时检测了熏烟2周小鼠BALF细胞和肺组织中的elastin的表达,其相较于对照组,确实有一定的增加,说明MMP-12的分泌增加后,极有可能导致肺组织弹性纤维的降解,而导致游离的elastin及其多肽的表达升高。熏烟2周小鼠T细胞体外培养实验还证实,elastin可在体外,刺激熏烟小鼠CD4+T细胞向Th1及Th17细胞分化增加。这些结果为elastin作为一种自身免疫抗原参与慢阻肺的发病过程提供了直接证据。我们用elastin的中和抗体,BA4干预CE-急性模型后,发现其可明显抑制CE诱导的气道炎症(如BALF细胞总数明显降低,中性粒细胞总数及比例明显缓解,HE病理显示炎症细胞浸润缓解及ELISA结果显示炎症因子-IL-6及趋化因子CXCL1等表达明显下降)及气道粘液高分泌(病理切片PAS染色显示粘液表达明显降低)。且T细胞体外培养的结果显示,BA4可明显抑制elastin对Th细胞的诱导分化。这些结果都进一步证实了 elastin在慢阻肺自身免疫过程中的重要作用。用IL-17A KO及其同窝对照小鼠构建CE-急性模型,发现在IL-17缺失后,CE诱导的气道炎症(如BALF细胞总数明显降低,中性粒细胞总数及比例明显缓解,HE病理显示炎症细胞浸润缓解及ELISA结果显示炎症因子-IL-6及趋化因子CXCL1,CXCL2)及气道粘液高分泌(病理切片PAS染色)均被明显抑制。这些结果都进一步说明了 Thl7细胞及IL-17A因子参与并调节了慢阻肺的自身免疫过程。结论:我们的研究,首次在小鼠动物实验中证实,香烟烟雾暴露可激活肺巨噬细胞,使其分泌的MMP-12增加,从而降解肺组织弹性纤维,使elastin及其多肽产生增加。肺内增加的elastin及其多肽可被肺内APC所摄取,并将其递呈给Th1及Th17细胞,从而使IFN-γ和IL-17A的分泌增加,进一步驱化和诱导以巨噬细胞及中性粒细胞为主的炎症细胞,从而使肺组织进一步降解,产生更多的elastin及其多肽。该过程反复进行,逐步加重肺内炎症和肺组织结构和功能破坏,最终导致肺气肿的形成。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R563.9;R-332

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