鞭毛素蛋白作为鼻腔黏膜佐剂调节呼吸道DC功能并增强IgA应答的机制研究

发布时间：2017-12-29 09:18

  本文关键词：鞭毛素蛋白作为鼻腔黏膜佐剂调节呼吸道DC功能并增强IgA应答的机制研究　出处：《中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)》2017年博士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 鞭毛素 黏膜佐剂 IgA应答 黏膜上皮细胞 树突状细胞 GM-CSF

【摘要】：鞭毛素(flagellin)是细菌鞭毛丝状体的主要结构蛋白。作为一类独特的细菌病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),flagellin具有激活Toll-like receptor 5(TLR5)和NLR family CARD domain containing 4(NLRC4)两条信号通路的免疫活性。大量研究表明,flagellin能以TLR5和/或NLRC4通路依赖的方式有效激活免疫应答,可以作为免疫佐剂有效增强疫苗抗原特异性的免疫应答。近年来一系列研究证明flagellin蛋白更是一种优良的黏膜免疫佐剂,能通过黏膜免疫途径显著提高疫苗抗原特异的黏膜IgA应答,并提高疫苗保护效应。然而,flagellin作为黏膜佐剂增强特异IgA免疫应答的作用过程及其免疫学机制尚知之甚少。本论文采用小鼠鼻腔免疫模型,对重组flagellin蛋白在鼻腔黏膜上皮细胞的摄入、与黏膜局部免疫细胞的相互作用、以及增强黏膜特异IgA应答效应和分子机制等方面进行了系统研究。第一,观察并测定了经鼻免疫小鼠后,flagellin蛋白在小鼠鼻腔黏膜局部的摄入和分布特征。免疫组化分析显示小鼠鼻腔黏膜上皮细胞(murine nasal epithelial cells,mNECs)在腔面高表达TLR5,但flagellin在野生型(WT)和TLR5基因敲除(TLR5 KO)小鼠的鼻腔内均能被mNECs有效摄取并快速(0.5h)分布到黏膜固有层。流式细胞分析显示flagellin-EGFP融合蛋白在鼻腔黏膜下可快速被鼻腔树突状细胞(nasal DC)摄取(2h)。由此,我们发现并证明:flagellin蛋白能以非TLR5依赖的方式迅速而有效地被鼻腔黏膜上皮细胞摄取并分布于黏膜固有层,且能被鼻腔黏膜下nasal DC有效摄取。第二,进一步观察和测定了flagellin蛋白作为佐剂经鼻腔黏膜摄入后与呼吸道DC的相互作用和效应。使用flagellin作为黏膜佐剂与抗原OVA-AlexaFluor647混合滴鼻免疫小鼠,我们发现:与单纯荧光抗原OVA免疫组相比,flagellin不能提高nasal DC中OVA+DC比例及nasal DC所含的OVA量(2h),但能提高WT小鼠颈部引流淋巴结(CLN)中OVA+DC数目,且明显上调CLN DC表面CD80/CD86分子(18h)。采用离体DC与na?ve B细胞体外共培养模型,我们从flagellin免疫后的WT及TLR5 KO小鼠体内分离CLN DC(18h),分别检测离体CLN DC促进na?ve B细胞抗体应答的能力,结果显示:flagellin滴鼻免疫调节的WT CLN DC能够增加B细胞中IgA+细胞数目,并增强IgA分泌。由此,我们发现并证明:flagellin作为鼻腔黏膜佐剂,并不促进DC对免疫抗原的摄取,而是以TLR5依赖的方式促进DC的活化、DC迁移以及介导IgA应答。第三,观察分析了flagellin活化呼吸道DC并促进IgA应答的作用方式及分子机制。实验结果表明:flagellin直接刺激呼吸道DC,能轻微上调DC表面CD80分子,但不能上调CD86分子。这种部分激活的DC不能增强na?ve B细胞的IgA应答。采用小鼠原代mNECs体外培养模型,我们发现鼻腔黏膜上皮细胞是flagellin活化呼吸道DC及促进后续IgA应答的一个必须环节。实验结果表明,flagellin必须通过激活mNECs的TLR5通路,才能将激活信号传递到DC,赋予DC增强na?ve B细胞IgA应答的能力。进一步采用细胞因子芯片结合特异性中和抗体阻断等实验技术,确认了GM-CSF是TLR5激活的mNECs传递激活信号并调节DC功能的关键细胞因子。本部分研究证明了flagellin间接激活黏膜DC的模式,并揭示了GM-CSF在介导TLR5激活的mNECs调节DC功能、增强特异性IgA应答中的重要作用。综上所述,本论文证明了flagellin蛋白在鼻腔黏膜局部可被mNECs快速有效摄入,此摄入过程不依赖TLR5。进入到黏膜下的flagellin蛋白不能直接激活呼吸道DC,而是通过激活mNEC/TLR5产生的GM-CSF等细胞因子调节DC功能进而增强IgA应答。因此,本论文系统阐明了鞭毛素蛋白鼻腔免疫的黏膜佐剂效应及其调节呼吸道DC功能并增强IgA应答的分子机制,发现了GM-CSF在这一免疫激活过程中的重要功能。研究结果为更有效利用重组鞭毛素蛋白进行黏膜疫苗的设计奠定了理论基础,对进一步研究了解呼吸道黏膜免疫应答的独特机制也具有重要参考价值。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

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本文编号：1349688