TREM-1对大肠杆菌或双链RNA诱导巨噬细胞活化的调控作用及分子机制

发布时间：2017-12-29 14:56

本文关键词：TREM-1对大肠杆菌或双链RNA诱导巨噬细胞活化的调控作用及分子机制　出处：《第三军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：致病原感染机体后,其本身固有的特殊成分——病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMPs)能够被机体先天免疫细胞的模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)识别,一方面启动病原的吞噬、清除和杀伤,一方面激活机体炎症反应。而由严重感染所致失控性炎症反应是引发感染患者多器官功能损伤、甚至衰竭的重要原因。由于其病死率高,目前还缺乏十分有效的防治手段。新近的研究证实表达于髓样细胞的TREM-1(triggering receptors expressed on myeloid cells-1,TREM-1)在先天免疫系统中具有重要调控作用。该受体活化能够显著上调革兰阴性细菌/LPS作用于多形核白细胞后多种促炎症细胞因子的产生,显著放大感染相关炎症信号,在感染所致脓毒症的发生发展中具有重要的作用,故极有可能是抗脓毒症治疗研究的重要靶分子。而革兰阴性细菌通过其表面的LPS作用于TLR4(Toll-like receptor 4)/MD-2(Myeloid differentiation protein-2)受体复合体触发的炎症信号的过度放大是内毒素血症的发生发展基础,但以此为靶分子抑制LPS触发放大的炎症信号治疗内毒素血症动物模型并不一定能取得良好的疗效。其原因可能是干预TLR4/MD-2受体复合体的功能对先天免疫系统内化、杀伤、清除革兰阴性细菌和LPS影响甚巨,导致严重的副作用。TREM-1受体虽然对炎症信号的级联放大具有重要调控作用,但该受体是否对于先天免疫系统识别、吞噬、杀伤、清除革兰阴性细菌/LPS有作用以及作用的大小尚没有完全认识清楚。鉴于此,本研究通过基因工程方法构建表达EGFP的大肠杆菌,以此为工具研究证实了TREM-1活化对小鼠巨噬细胞内化及细胞内杀伤大肠杆菌具有促进作用。由于TREM-1为髓样细胞表面的一种膜受体,本身缺乏识别LPS/大肠杆菌的分子结构,故直接参与巨噬细胞内化大肠杆菌过程的可能性不大。为深入探讨可能机制,本研究通过构建慢病毒并感染RAW264.7细胞获得差异表达TREM-1的细胞株,并运用基因芯片技术比较了差异表达TREM-1的细胞株之间的全基因组表达谱差异,以期探讨差异表达TREM-1对内化大肠杆菌关键受体或信号分子的影响。在构建差异表达TREM-1细胞株的过程中,我们发现了一个新的现象。即对照慢病毒感染的细胞株,TREM-1表达显著升高。而已知慢病毒的感染过程为所谓的“自杀式感染”,感染后可将靶序列整合到宿主细胞基因组,但并不会复制包装产生新的病毒。而整合到宿主基因组的序列可不断转录产生新的ds RNA。这说明对照慢病毒产生的外源性乱序ds RNA可以诱导TREM-1表达上调。而ds RNA是双链RNA病毒最主要的PAMPs之一,机体的免疫细胞则是通过其PRRs识别胞浆或内体中的ds RNA,进而分泌Ⅰ型干扰素和炎症介质,产生抗病毒免疫,并产生炎症反应。尽管已有多项研究证实TREM-1受体参与调控了机体先天免疫系统对革兰阳性细菌、真菌及病毒产生的多种PAMPs的识别及后续信号过程,但TREM-1受体是否在机体先天免疫系统识别ds RNA后产生的抗病毒免疫中发挥调节作用还缺乏深入的认识。故本研究证实外源性ds RNA能够上调TREM-1的表达,且TREM-1活化可能正向调控ds RNA诱导的抗病毒免疫,而TREM-1的这种调节效应与该受体活化能够上调MAPK信号通路活性及病毒感染相关的PRRs表达有关。主要的实验方法和结果:1.分别用经2%血清调理素化的和未经调理的大肠杆菌BL21(DE3)plys S感染BMDMs,12hrs后收集细胞培养上清,ELISA法检测上清中TNF-α和IL-6的浓度。结果发现感染经血清调理或未调理的大肠杆菌的细胞培养上清中,TNF-α和IL-6的分泌均明显上调(P0.01);而用TREM-1激动型抗体活化该受体后再感染细菌,则TNF-α和IL-6的分泌效应被显著放大(P0.05);而单独比较调理素化和未调理细菌对巨噬细胞的刺激作用,则发现调理素化细菌对TNF-α和IL-6的分泌具有更强的诱导作用(P0.05)。2.通过基因工程方法构建EGFP原核表达载体,转化入表达大肠杆菌后,通过诱导EGFP表达使细菌携带稳定绿色荧光,从而获得能够可视化研究吞噬细胞内化细菌过程及通过流式细胞术定量、高通量测定吞噬细胞内化能力的有力工具。3.使用TREM-1受体激动型抗体与BMDMs孵育半小时活化该受体,加入细菌感染细胞半小时,可检测到TREM-1受体活化的细胞内化有细菌的比例显著增加,细胞平均荧光强度显著增加,吞噬系数增高(P0.01)。在不同时像点收集保本检测结果也证实TREM-1活化促进BMDMs对大肠杆菌的吞噬。同时,也采用同样方法检测RAW264.7细胞内化大肠杆菌的能力,结果发现RAW264.7细胞内化大肠杆菌的能力弱于BMDMs,且TREM-1受体活化不能显著上调RAW264.7细胞内化大肠杆菌能力。4.用TREM-1受体激动型抗体与巨噬细胞孵育半小时后,向细胞培养上清中加入荧光标记乳胶微球和中性红颗粒,结果发现细胞非特异胞饮能力并未增强,而作为实验对照的经LPS刺激半小时的BMDMs的胞饮能力显著增强(P0.01)。5.同样激活BMDMs的TREM-1受体,并使其内化大肠杆菌。然后用抗生素杀灭胞外菌后,再继续培养细胞5hrs进行细胞内杀伤大肠杆菌,通过裂解细胞进行菌落计数发现TREM-1受体活化的BMDMs的细胞内杀伤大肠杆菌的能力显著增强(P0.05)。6.慢病毒感染RAW264.7细胞,对照慢病毒感染组细胞的TREM-1表达上调,而敲减TREM-1表达并不影响TLR4、MD-2表达。TREM-1受体活化增强巨噬细胞内化革兰阴性细菌,可能与该受体活化调节TLR4受体功能及MAPK等信号通路有关。7.Poly IC刺激RAW264.7细胞,可剂量依赖地上调TREM-1的表达(P0.001),这一效应可被PI3K、MAPK信号通路抑制剂阻断(P0.01)。Poly IC刺激BMDMs可持续上调TREM-1表达,在刺激后36hrs达到高峰,而LPS诱导的TREM-1表达上调在24hrs即达到高峰,随后下跌。短片段ds RNA对TREM-1表达同样具有诱导作用。8.细胞与激动型anti-TREM-1抗体孵育活化TREM-1,再经Poly IC刺激后,其MAPK信号通路的JNK、ERK1/2和P38的磷酸化发生更早,磷酸化水平更高,而且持续时间更长,MAPK信号通路活化程度增强。9.经TREM-1激动型抗体处理的BMDMs细胞受到Poly IC刺激活化后,IFN-β、TNF-α、IL-6的分泌水平显著上调(P0.01),IL-1β、IL-10、MCP-1的m RNA转录显著增强。且RAW264.7细胞与BMDMs细胞的TREM-1受体功能存在差异。10.TREM-1受体活化的BMDMs细胞受Poly IC刺激后,MDA5、TLR3和TLR7受体表达上调;而受到短片段ds RNA刺激后表现为RIG-I表达上调。RAW264.7细胞的上述受体表达存在异常。结论:1.TREM-1受体活化选择性促进巨噬细胞内化和细胞内杀伤大肠杆菌,从而上调促炎症介质分泌,但并不增强细胞非特异的胞饮能力。2.敲减TREM-1表达并不能改变TLR4、MD-2等内化革兰阴性细菌相关基因的表达。TREM-1促进巨噬细胞内化革兰阴性细菌能力的机制可能与该受体活化能调节TLR4/MD-2受体复合体功能及细胞MAPK等信号通路活化状态有关。3.基因组表达谱芯片及体外实验结果证实ds RNA刺激巨噬细胞能上调TREM-1的表达,存在剂量和时间依赖性。4.TREM-1活化状态对ds RNA诱导的抗病毒免疫反应具有重要的调节作用,参与病毒感染过程的发生、发展;而这种调节作用与其能协同增强MAPK信号通路活化及病毒相关PRR表达有关。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

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