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分化状态与丝素蛋白纤维物理性状影响间充质干细胞的迁移及机制研究

发布时间:2017-12-29 19:29

  本文关键词:分化状态与丝素蛋白纤维物理性状影响间充质干细胞的迁移及机制研究 出处:《苏州大学》2015年博士论文 论文类型:学位论文


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【摘要】:间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可从自体获得,取材容易、对供体伤害小、免疫原性弱、且来源广泛,因此MSCs成为细胞移植治疗的理想种子细胞;而MSCs向病变部位的迁移在细胞移植治疗中起到至关重要的作用。在体外长期培养的过程中,MSCs可以始终保持其多向分化潜能,包括向神经细胞分化的能力。文献报道,体内移植的MSCs能够迁移到大脑病变或损伤部位,参与神经系统在细胞和组织水平上的重建并实现部分功能的恢复;移植后的MSCs能够分化成神经元和神经胶质细胞等神经类细胞,并可以分泌多种细胞因子保护和促进组织的修复。因此MSCs修复甚至替换丧失功能的神经元从而治疗包括外周神经系统损伤以及脊髓损伤、脑梗塞、脑损伤等中枢神经系统疾病成为可能;近年来已有在体外分化成神经样细胞的MSCs用于动物体内移植治疗帕金森综合征的报道。然而体内试验证明,只有很少量的MSCs迁移至损伤或病变部位,其中真正分化为神经细胞并行使功能的MSCs更为稀少,大部分移植的细胞停留在注射部位(定点移植)或通过血液循环(静脉注射)分散在体内多处。因此,提高MSCs的定向迁移能力,增加迁移到损伤部位的移植细胞数量对改善治疗至关重要。MSCs定向迁移或趋化性迁移受到多种因素的调控,其中细胞因子和化学趋化因子在这一过程中起到非常重要的作用。体内外实验证明神经系统损伤区域会分泌基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α),SDF-1α与其受体CXCR4特异性结合,激活PI3K/Akt和MAPKs信号通路,导致细胞骨架重组,从而诱导MSCs定向迁移,广泛参与体内多种病理、生理反应,包括血管生成、心脏发育以及帕金森综合征的神经保护等,表明SDF-1α在神经系统损伤修复中非常重要。除了趋化因子影响MSCs的定向迁移,许多内在因素,包括MSCs对因子的不同应答程度也是影响其定向迁移的重要因素。MSCs对趋化因子的应答可能与其分化程度密切相关。研究表明,不同组织来源和处于不同细胞周期的MSCs具有不同的迁移能力,对趋化因子的应答也存在差异。由于移植的细胞是一个细胞群体,其中含有处于不同分化阶段的细胞,对趋化因子产生应答作用的MSCs很有可能只是处于特定分化状态的细胞群体,弄清这些细胞的特性,阐明它们对趋化因子表现的高趋向性机理,不仅对于揭示MSCs定向迁移的分子机制具有重要的理论意义,而且有利于发现MSCs趋化性迁移的条件和分化状态,为今后细胞移植治疗神经系统疾病提供实验和理论基础。本研究通过碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)联合丁羟基茴香醚(butyl hydroxyl anisol,BHA)诱导MSCs成神经分化,分为5个状态,分别是未分化、预诱导24 h、诱导5 h、维持18 h和维持48 h;运用Boyden chamber实验和Western blot检测不同分化状态的MSCs对SDF-1α趋化性应答差异及其内在分子机制,得到了以下结果:SDF-1α诱导的MSCs趋化性迁移与其分化状态密切相关为了探讨MSCs的趋化性迁移和它们成神经分化状态之间的关系,利用Boyden chamber检测了MSCs向不同浓度(0-100 ng/ml)的SDF-1α的趋化性迁移。结果发现25 ng/ml的SDF-1α可以促进未分化、预诱导24 h、诱导5 h、维持18 h的MSCs迁移,5、50 ng/ml的SDF-1α均能够引起预诱导24 h、诱导5 h、维持18 h的MSCs迁移,但趋化性应答程度不同,而100 ng/ml的SDF-1α仅能够引起预诱导24 h和诱导5 h阶段的MSCs发生趋化性迁移。以上数据说明分化状态不同,MSCs向SDF-1α趋化迁移能力存在显著差异,MSCs定向迁移行为与分化状态密不可分。预诱导24 h的MSCs具有最强的趋化迁移能力为了寻找MSCs成神经分化过程中向SDF-1α定向迁移能力较强的某个特定分化状态,我们检测了不同分化状态的MSCs向25 ng/ml的SDF-1α的趋化应答。结果显示预诱导24 h的MSCs相较于其它状态对25 ng/ml的SDF-1α表现出较强的趋化反应,说明预诱导24 h的MSCs具有最强定向迁移能力,同SDF-1α未刺激组相比有1.53倍提升。PI3K/Akt和MAPKs信号通路的激活程度与细胞的分化状态密切相关前期实验发现SDF-1α刺激后不同分化状态的MSCs的迁移能力不同,那么与细胞迁移密切相关的PI3K/Akt和MAPKs信号通路是否参与调节SDF-1α诱导的细胞迁移呢?于是我们通过Western blot检测了SDF-1α处理成神经分化不同状态的MSCs后PI3K/Akt和MAPKs信号通路关键分子的磷酸化水平,其中包括Akt、ERK1/2、SAPK/JNK和p38MAPK。首先使用不同浓度的SDF-1α(0-100ng/ml)处理未分化的MSCs,检测发现PI3K/Akt和MAPKs信号通路关键分子的磷酸化水平呈现浓度依赖性,25 ng/ml的SDF-1α能够显著提高未分化的MSCs中Akt、ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平。接下来我们检测了不同分化状态的MSCs中这些信号分子的磷酸化水平,结果发现:不同分化状态的MSCs均表达基底水平的Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK;与未分化的MSCs相比,Akt和ERK1/2的磷酸化水平在诱导5 h和维持48 h阶段提高,p38MAPK磷酸化水平在维持18 h和48 h阶段提高;磷酸化的SAPK/JNK在维持18 h的MSCs中显著提高,而在预诱导24 h和维持48 h的MSCs中下降。以上结果说明分化状态的不同直接影响着PI3K/Akt和MAPKs关键信号分子基底水平的磷酸化表达。SDF-1α刺激后引起的PI3K/Akt和MAPKs信号通路关键分子的激活时间与持续时间在不同分化状态的细胞中有较大差异接下来我们使用25 ng/ml的SDF-1α处理不同分化状态的MSCs不同时间(0、5、15、30和60 min)进一步检测这些信号分子的磷酸化水平,SDF-1α处理后,未分化及维持18 h的MSCs中Akt磷酸化从5 min开始增加,但持续时间不同,在诱导5 h和维持48 h的MSCs中发生下降;ERK1/2磷酸化从SDF-1α刺激5 min时,未分化、诱导5 h、维持18 h状态的MSCs水平升高,但磷酸化程度及持续时间各不相同;SAPK/JNK磷酸化在预诱导24 h的MSCs中SDF-1α刺激5 min时显著升高并且持续到60 min,在所有维持状态的MSCs中SAPK/JNK的磷酸化水平从5 min开始降低并持续到60 min;p38MAPK磷酸化水平,仅在未分化的MSCs中SDF-1α处理后15 min和60 min时显著提高,在维持18 h的MSCs中p38MAPK水平在15min时显著升高,并在30 min时降到基底水平,在60 min时发生降低。这些结果说明,不同分化状态的MSCs中PI3K/Akt和MAPKs对SDF-1α的应答存在差异。PI3K/Akt和MAPKs信号通路参与调节SDF-1α诱导的不同分化状态MSCs的定向迁移为了进一步分析PI3K/Akt和MAPKs信号通路在SDF-1α诱导的MSCs迁移过程中的作用,分别采用30μM LY294002(PI3K/Akt抑制剂)、50μM PD98059(ERK1/2抑制剂)、30μM SB203580(p38MAPK抑制剂)或10μM SP600125(SAPK/JNK抑制剂)预处理不同成神经分化状态下的MSCs 30 min,将细胞置于Boyden chamber装置中,检测其向25 ng/ml SDF-1α定向迁移的情况。结果显示,阻断PI3K/Akt信号显著降低了未分化、维持18 h和维持48 h的MSCs迁移至下室的细胞数;阻断SAPK/JNK信号抑制了SDF-1α诱导的未分化、预诱导24 h、维持18 h和维持48 h的MSCs迁移;阻断ERK1/2信号减少了诱导5 h和维持48 h的MSCs迁移数目;阻断p38MAPK信号抑制了维持18 h和48 h的MSCs迁移。总之,PI3K/Akt和MAPKs信号通路参与调节SDF-1α诱导的MSCs迁移,而其程度则依赖于MSCs分化状态。上述实验结果表明,特定分化状态的MSCs相较于其他状态拥有更强的迁移能力和趋化反应,说明了分化状态对MSCs迁移的重要作用,我们可以充分利用特定分化状态的MSCs进行细胞移植从而更有效地改善一些神经类疾病的结构和功能修复。神经损伤不仅造成了损伤区域大量细胞的丢失,而且改变了局部微环境,损伤区域有大量胶质细胞的浸润和结缔组织增生,导致了胶质瘢痕的形成,不利于神经损伤恢复,难以重建中枢神经系统。因此,具有较强迁移能力的MSCs不仅需要到达损伤部位,分化成神经样细胞,更为重要的是与周围环境建立联系,进而分泌一些神经营养因子,促进神经系统损伤恢复,这是影响疗效的一个至关重要的因素。针对上述问题,我们认为或许可以利用组织工程的方法,寻找一种合适的仿生材料,模拟细胞外基质错综复杂的蛋白网络结构,为MSCs生长提供粘附点,帮助和引导MSCs定向有序地迁移至受损部位,从而促进神经修复。丝素蛋白(silk fibroin,SF)易加工成各种形状且在生物体内降解可控,这两大优势使其成为一种极具开发潜力的医用组织工程替代品,目前模拟天然细胞外基质的纳米结构成为组织工程修复运用的焦点,本文开展的第二部分内容是借助再生SF纤维与MSCs极好的生物相容性,制备细胞外基质仿生材料,研究不同直径(100、200、400 nm)和不同走向(平行或乱序)的SF纤维对不同分化状态MSCs粘附、铺展、生长和迁移等特性的影响,寻找最适合MSCs生长、迁移的最佳SF纤维的物理性状以及MSCs成神经分化过程中的最佳细胞状态,为今后利用神经组织工程移植的办法治疗神经损伤提供理论指导。第二部分研究结果如下:直径100、200 nm的SF纤维更有助于MSCs粘附生长;SF纤维支持不同分化状态MSCs生长我们将P5代的MSCs分别接种到不同直径的SF纤维以及对照组多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)上,培养3 d、6 d、9 d,结果发现培养3 d时,100、200 nm小直径SF纤维上的MSCs的粘附能力明显高于对照组。培养6 d时,发现SF纤维上的MSCs都发生了增殖。培养9 d时,直径100、200 nm SF纤维上的MSCs增殖快,明显高于对照组。实验结果表明直径100、200 nm SF纤维更有助于MSCs的增殖,可能是由于纤维直径的变细而增加了表面积,而较高的表面积可以从培养基中摄取更多的粘附蛋白基团,从而为细胞的附着和生长提供更多的粘着点。接着我们研究了不同直径的SF纤维对成神经分化过程中不同分化状态MSCs生长的影响,发现SF纤维上细胞分化形态及细胞存活率与对照组无差异,说明SF纤维支持不同分化状态MSCs生长。SF纤维有助于提高MSCs某些特定分化状态的迁移速率,而SF纤维直径和MSCs分化状态直接影响其迁移速率MSCs的运动能力直接影响治疗效果,如果能够更好地弄清MSCs在SF纤维上的迁移行为,无疑为MSCs进行临床移植治疗带来希望。本实验采用10代以内的MSCs,接种在不同直径和不同走向的SF纤维上,将其成神经诱导分化,进行体外培养,结合活细胞显微摄影实时跟踪,分析不同直径的SF纤维对成神经分化过程中不同分化状态MSCs迁移能力的影响。结果发现直径100、200 nm SF纤维能够显著提高未分化、预诱导24 h和诱导5 h的MSCs迁移速率(speed),而直径400 nm SF纤维仅提高了未分化和预诱导24 h MSCs的迁移速率,SF纤维上维持18 h和维持48 h MSCs迁移速率与对照组无显著差异。结果说明SF纤维能够促进MSCs成神经分化过程中某些特定分化状态细胞的迁移速率;不同分化状态的细胞迁移速率不同,其中预诱导24 h的MSCs具有最强的迁移速率。直径200 nm和400 nm平行排列的SF纤维显著提高了不同状态MSCs的迁移效率衡量细胞迁移能力的要素有2个,一个是迁移速率,另一个则是迁移效率(forward migration index,FMI)。迁移效率是指细胞迁移的直线距离/总距离,反应了细胞迁移持续性。我们的实验结果发现平行SF纤维上MSCs的迁移效率显著高于对照组和乱序组,说明平行排列的SF纤维能够引导细胞沿着纤维迁移,大大提高了MSCs的迁移效率,充分说明SF纤维的走向对MSCs的迁移具有导向作用;不同分化状态的MSCs具有不同的迁移效率,预诱导24 h的MSCs迁移效率最高;直径200 nm和400 nm平行SF纤维显著提高了成神经分化过程中不同状态MSCs的迁移效率,而100 nm的SF纤维有助于未分化、预诱导24 h和诱导5 h的MSCs迁移。SF纤维直径不同,不同分化状态MSCs中PI3K/Akt和ERK1/2信号通路关键信号分子的磷酸化表达不同我们前期研究发现PI3K/Akt和ERK1/2信号参与了各种生长因子激活下游信号分子介导细胞迁移,那SF纤维提高不同分化状态MSCs的迁移速率是否也通过PI3K/Akt和ERK1/2信号通路?于是,我们选择直径为200 nm和400 nm SF纤维以及3种不同的分化状态(未分化,预诱导24-h和维持18-h,这3种状态分别代表对照组、成神经分化过程中MSCs具有高迁移能力组和低迁移能力组)进行研究。结果表明,在3个不同分化状态的MSCs中,培养在200 nm SF纤维上的MSCs,与PLL组相比,ERK1/2的磷酸化水平增强,而直径400 nm的SF纤维只激活未分化和预诱导24 h的MSCs中ERK1/2信号。同时,预诱导24 h的MSCs中PI3K/Akt信号不管是在直径200 nm还是400 nm SF纤维上均被激活,另外,直径200 nm SF纤维上未分化MSCs和400 nm SF纤维上维持18 h MSCs中Akt的磷酸化也升高。上述结果表明,不同SF纤维直径与分化状态直接影响PI3K/Akt和ERK1/2信号通路关键分子磷酸化。PI3K/Akt和ERK1/2信号通路参与调节SF纤维上不同分化状态MSCs的迁移为了进一步研究PI3K/Akt和ERK1/2信号通路在SF纤维促进的MSCs迁移过程中的作用,我们分别用PI3K/Akt和ERK1/2信号关键分子Akt和ERK1/2的抑制剂LY294002和PD98059预处理MSCs 30 min,通过活细胞工作站实时跟踪拍摄3个不同分化状态的细胞在直径200 nm和400 nm SF纤维上的迁移轨迹,计算迁移速率。结果表明,当用LY294002阻断PI3K/Akt信号通路后,培养在直径200 nm的SF纤维上未分化和维持18 h的MSCs迁移速率明显降低,阻断ERK1/2信号通路后明显抑制了预诱导24 h和维持18 h的细胞迁移速率;对于直径400 nm SF纤维组,抑制PI3K/Akt和ERK1/2信号通路均削弱了未分化和预诱导24 h的MSCs迁移速率。这些结果表明,PI3K/Akt和ERK1/2信号通路介导了不同分化状态MSCs在SF纤维上的迁移。本论文第一部分研究工作发现不同分化状态的MSCs具有不同的迁移能力,对不同浓度的SDF-1α趋化性应答也不同,对SDF-1α产生应答作用的MSCs很有可能只是处于某个特定分化阶段的MSCs才表现出超强的趋化迁移能力,提示MSCs的迁移能力和它们的分化状态密切相关。论文第二部分研究发现直径100、200 nm的SF纤维促进MSCs粘附与生长;不同直径的SF纤维支持不同分化状态MSCs的生长;平行排列的SF纤维能够引导细胞迁移持续性,直径介于200 nm与400 nm平行排列的SF纤维显著提高了不同分化状态MSCs的迁移效率;PI3K/Akt和ERK1/2信号通路参与调控SF纤维上MSCs的迁移。综上所述,将处于特殊分化状态具有最强迁移能力的细胞群体与适合MSCs生长的最佳性状的SF纤维一同移植入体内,为临床应用MSCs治疗中枢神经系统疾病及损伤修复提供一个理论参考。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R329.2

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本文编号:1351572

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