内蒙古EV71病毒C008株抗VP1血清的制备与中和效果的测定

发布时间：2018-01-01 17:36

  本文关键词：内蒙古EV71病毒C008株抗VP1血清的制备与中和效果的测定　出处：《内蒙古大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：肠道病毒 71 型(Enterovirus71,EV71),属于小 RNA 病毒科(Picornavirus)肠道病毒属(Enterovirus),是一直径大约30 nm的二十面体立体对称的小球型结构,无包膜和突起,由外层衣壳和RNA核心构成。近十年间EV71成为亚太地区手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原体。而且感染EV71病毒后有可能出现高烧、神经系统并发症、肺水肿和致死性脑炎。现今针对EV71感染没有有效治疗药物,预防所用的灭活疫苗是否可达到预期的效果还有待观察。同时EV71病毒分型众多,不同地区发生EV71感染往往呈不同流行特点。了解内蒙古本地EV71病毒的分型和作为抗原的性质,有助于进一步研究更安全有效的疫苗。EV71病毒衣壳颗粒由四种结构蛋白VP1～VP4组成,包围着约7.4kb的单股正链RNA。除了 VP4包埋在病毒粒子的内侧与病毒核心紧密连接外,其他三种结构蛋白均暴露在病毒表面,因此这三种蛋白拥有EV71病毒主要的抗原决定簇。据研究,KP1基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)区易于变异,这种变异提供了病毒遗传多样性,也成为病毒分型的主要依据。并且,VP1蛋白上的抗原决定簇是病毒抗原性的决定因子,抗体中和反应的抗原表位多集中于此。因此在研究EV71病毒的时候,VP1蛋白的研究成为主要的研究方向,有望成为重组蛋白疫苗。为了深入了解内蒙古本地EV71病毒的基因分型和制备针对EV71病毒VP1蛋白的抗体及重组疫苗,本实验提取EV71病毒的总RNA,根据GenBank中储存的EV71病毒VP1蛋白的基因序列设计引物,用一步法RT-PCR得到VP1 cDNA约为891bp。将得到的PCR产物与pET3a载体连接,得到重组表达质粒pET-VP1。再通过设计含有HIS标签的引物以pET-VP1载体为模板进行PCR,得到了上游带有HIS标签的VP1 cDNA序列约为909 bp。PCR产物与pET3a连接得到第二种重组表达载体pET-HIS-VP1。将两种重组质粒转入大肠杆菌BL21菌体中高效表达,获得了 VP1蛋白和HIS-VP1重组蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白大小约37kDa。用纯化的VP1蛋白和HIS-VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱发小鼠产生抗VP1血清。同时用EV71病毒免疫BALB/c小鼠,同样得到了抗EV71病毒的血清。使用上述3种血清进行Western Blot和病毒中和实验,检测其保护作用。Western Blot实验结果显示,三种血清都对VP1蛋白和HIS-VP1蛋白有特异性,中和实验表明抗VP1蛋白血清和抗HIS-VP1蛋白血清均可在1:65 536稀释度时对细胞产生保护作用,二者无显著差异,而对照组抗完整病毒的血清在1:81 920稀释度时,对细胞产生保护作用。抗VP1蛋白血清的中和病毒能力虽然不如抗完整病毒的血清,但效果非常明显。鉴于原核表达带HIS标签的VP1蛋白安全,可大量制备,容易纯化,有望成为肠道病毒71型的基因工程疫苗。
[Abstract]:EV71 virus ( EV71 ) is a main pathogen of human foot and mouth disease ( HFMD ) . Western Blot showed that three kinds of serum were specific for VP1 protein and HIS - VP1 protein . The results showed that anti - VP1 protein serum and anti - HIS - VP1 protein could protect the cells at 1 鈭，

本文编号：1365532