RSV诱导Hep2细胞自噬在病毒复制中的作用及其机制研究

发布时间：2018-01-12 17:36

本文关键词：RSV诱导Hep2细胞自噬在病毒复制中的作用及其机制研究　出处：《河北医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：病毒侵入机体后,与宿主的相互作用与博弈决定着疾病的进程和转归。在二者相互作用过程中,自噬和凋亡机制发挥重要作用。自噬是真核生物中一种高度保守的细胞代谢过程,它通过溶酶体途径对胞内蛋白质或受损细胞器进行降解,有助于维持细胞稳态,促进细胞存活。病毒感染可通过多种途径诱导自噬,自噬在病毒和宿主细胞互作过程中发挥双重作用:一方面,它通过多种方式发挥抗病毒作用,如活化TLR、促进病毒抗原加工处理和提呈、直接包裹并降解病毒等;而病毒作为一种专性的胞内寄生微生物,在与宿主细胞长期博弈过程中,进化出一系列逃逸甚至策反自噬的机制以促进自身存活和复制,如阻止自噬体和溶酶体融合,重塑内膜系统形成病毒膜相关复制“工厂”,下调免疫信号等。同自噬机制相同,凋亡在病毒和细胞互作过程中也发挥着“双刃剑”的作用。凋亡是细胞在基因控制下启动的一种主动的,有序的细胞死亡过程,细胞通过启动这种主动“自杀”方式限制病毒的复制和传播。而病毒在与其长期作用过程中,逐渐进化出多种利己的机制,促进自身复制和释放,如:以更高的效率在凋亡细胞中复制;延迟、抑制细胞凋亡促进自身复制;通过在特定阶段诱导凋亡而促进自身释放和传播。自噬和凋亡虽是两种完全不同的生理过程,但越来越多的研究证据显示:它们之间关系十分密切,可相互调控,甚至在特定条件下可相互转化,二者之间的动态平衡影响着病毒的生存和致病。探讨病毒和宿主细胞的相互作用是阐明病毒致病机理,开发抗病毒药物和疫苗的重要基础。呼吸道上皮细胞作为呼吸道的首道防御屏障,最先与呼吸道合胞病毒(RSV)相遇,而RSV与呼吸道上皮细胞是如何相互作用的,尚不清楚。我们以RSV作为模型病毒,从病毒和宿主细胞相互作用,从病毒、细胞自噬和凋亡相互调控角度出发,研究RSV对呼吸道上皮细胞自噬水平的影响以及自噬对病毒增殖动力学的影响,并试图从自噬和凋亡调控角度探讨其可能的机制。为深入阐明RSV和呼吸道上皮细胞相互作用关系,开发新的靶向自噬的抗病毒治疗方法奠定研究基础。第一部分RSV感染对呼吸道上皮细胞自噬活性的影响目的:探讨RSV感染对呼吸道上皮细胞自噬活性的影响方法:1 RSV对呼吸道上皮细胞自噬体形成的影响1.1不同感染复数(MOI=1、3、5)的RSV感染Hep2细胞4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h,Western blot检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达变化,确定RSV诱导自噬的MOI及时间。1.2 RSV感染Hep2细胞24 h、36 h、48 h,Western blot检测Atg12-Atg5泛素化系统活化情况及自噬相关蛋白Atg5、ATG7、Beclin1表达情况。1.3 p BABE-puro-EGFP-LC3质粒瞬时转染Hep2细胞24h后,RSV(MOI=5)再感染24 h,荧光显微镜观察胞浆EGFP-LC3蛋白的分布情况。1.4 RSV感染Hep2细胞24 h,透射电镜观察细胞内自噬体形成情况。2.RSV对呼吸道上皮细胞自噬流活性的影响2.1 RSV感染Hep2细胞24 h、48 h,Western blot检测细胞P62蛋白表达情况;2.2 10 n M巴弗洛霉素(bafilomycin A1,baf A1)预处理细胞2 h,RSV再感染24 h,Western blot检测细胞LC3Ⅱ及P62蛋白的表达。3 RSV感染对balb/c鼠肺组织自噬水平的影响SPF级6周龄balb/c鼠,经滴鼻感染RSV(106 PFU/只),分为8组,每组5只,分别于感染0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天将其处死,Western blot检测肺组织LC3Ⅱ蛋白的表达情况。结果:1 RSV诱导Hep2细胞自噬体数量增加1.1 RSV感染Hep2细胞,自24 h起自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达开始明显升高,一直持续至检测时间点48 h(P0.05)。1.2 RSV感染Hep2细胞24 h、36 h和48 h,ATG12-ATG5复合物及自噬相关蛋白Atg5,ATG7,Beclin表达明显增高(P0.05)。1.3 RSV感染改变Hep2细胞胞浆EGFP-LC3蛋白的分布,从均匀分布改为点状聚集分布。1.4透射电镜观察显示:RSV感染致Hep2细胞胞浆内形成大量双层膜自噬体结构。2 RSV诱导Hep2细胞完全的自噬流反应2.1 RSV感染Hep2细胞48 h,自噬流标志蛋白P62表达明显下降(P0.05)。2.2与单纯RSV感染比较,baf A1(10 n M)处理明显增加Hep2细胞LC3Ⅱ和P62表达水平(P0.05)。3 RSV诱导Balb/c鼠肺组织自噬增强RSV滴鼻感染Balb/c鼠,自3天起鼠肺组织LC3Ⅱ蛋白的表达明显增高,持续至检测时间点7天(P0.05)第二部分RSV通过ROS-AMPK-m TOR通路诱导Hep2细胞自噬目的:探讨ROS在RSV诱导呼吸道上皮细胞自噬中的作用及参与的信号分子方法:1 RSV感染Hep2细胞6 h、12 h、24 h,DCFH-DA探针法检测胞内活性氧(ROS)的水平。2 5 m M ROS抑制剂N-acetyl-l-cysteine(ROS抑制剂)预处理细胞2 h,RSV再感染24 h,Western blot检测LC3Ⅱ蛋白的表达,探讨ROS与自噬的关系。3 RSV感染Hep2细胞,取不同的时间点,Western blot检测信号分子p-AMPK、p-m TOR、p-ERK、p-JNK的表达变化。4分别用5μM Compoud C(p AMPK抑制剂)、10μM SP600125(JNK抑制剂)、10μM PD98059(ERK抑制剂)预处理Hep2细胞1 h,RSV再感染24 h,Western blot检测LC3Ⅱ的表达变化,探讨参与自噬诱导的信号通路。5 m M N-acetyl-l-cysteine预处理细胞2 h,RSV再感染24 h,Western blot检测p-AMPK,p-mTOR和LC3Ⅱ的表达变化,明确ROS与AMPK信号通路的关系。明确参与ROS依赖自噬诱导的主要信号通路。结果:1 RSV感染Hep2细胞,自6 h起胞内活性氧(ROS)水平开始增加,12 h明显增加,一直持续至检测时间点24 h。2 N-acetyl-l-cysteine(ROS抑制剂)可抑制RSV诱导的Hep2细胞LC3Ⅱ的高表达(P0.05),提示RSV通过ROS依赖机制诱导自噬。3 RSV感染Hep2细胞,信号分子p-AMPK的表达自6 h起明显升高,一直持续至检测时间点24 h(P0.05);p-m TOR的表达自6 h起明显降低,一直持续至检测时间点24 h(P0.05);MAPK通路的信号分子p-ERK的表达于30 min明显升高,一直持续至24 h(P0.05);p-JNK的表达于30 min明显升高(P0.05)。4 JNK抑制剂SP600125和ERK抑制剂PD98059不能抑制RSV诱导的Hep2细胞LC3Ⅱ的高表达(P0.05);AMPK抑制剂Compound C可逆转RSV诱导的Hep2细胞p-m TOR的低表达(P0.05)和LC3Ⅱ的高表达(P0.05)。提示AMPK-m TOR信号通路参与RSV诱导的自噬。N-acetyl-l-cysteine可逆转RSV诱导的Hep2细胞p-AMPK的高表达,p-m TOR的低表达(P0.05)和LC3Ⅱ的高表达(P0.05)。提示ROS位于AMPK-m TOR分子的上游调控RSV诱导的自噬。第三部分RSV诱导的细胞自噬通过抑制细胞凋亡促进病毒复制目的:探讨RSV诱导的细胞自噬对病毒增殖动力学的影响及其可能的机制方法:1 RSV诱导的Hep2细胞自噬对病毒增殖动力学的影响1.1分别用不同浓度的化学自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)和化学自噬抑制剂3-甲基腺苷(3-MA)或渥曼青霉素(wortmannin)预处理Hep2细胞2 h,RSV再感染24 h,Western blot检测LC3Ⅱ的表达变化,确定后续试验应用浓度。分别用100 n M rapamycin,1 m M 3-MA,100 n M wortmannin预处理p BABE-puro-EGFP-LC3质粒瞬时转染的Hep2细胞2h,RSV再感染24 h,荧光显微镜观察胞内EGFP-LC3蛋白点状聚集情况,验证其诱导和抑制自噬的效果。1.2分别用100 n M rapamycin,1 m M 3-MA,100 n M wortmannin预处理细胞2 h后,RSV再感染24 h或48 h,荧光定量PCR检测胞内病毒基因表达水平,Western blot检测胞内RSV F蛋白的表达变化,滴定细胞上清病毒滴度,从上述三方面评估自噬诱导和自噬抑制对病毒增殖动力学的影响。1.3构建针对Atg5,Atg7和Beclin1的sh RNA干扰质粒,包装慢病毒感染Hep2细胞,建立干扰Atg5,Atg7和Beclin1的稳定Hep2细胞系。以Hep2和Hep2-sh-luciferase为对照,Western blot检测Atg5,Atg7和Beclin1蛋白表达,验证其干扰效果;RSV感染上述细胞24 h,Western blot检测LC3Ⅱ的表达变化,进行功能验证。1.4 RSV感染Hep2-sh-Atg5,Hep2-sh-Atg7,Hep2-sh-Beclin和Hep2-sh-luciferase细胞24 h或48 h,荧光定量PCR检测细胞内病毒基因表达水平,Western blot检测胞内RSV F蛋白的表达变化,滴定细胞上清病毒滴度,从上述三方面评估干扰自噬相关基因抑制自噬对病毒增殖动力学的影响。2细胞自噬通过影响RSV诱导的细胞凋亡促进病毒复制2.1 1m M 3-MA预处理Hep2细胞2 h,RSV再感染48 h,Western blot检测full length casepase 3,cleaved-casepase 3,PARP,cleaved-PARP蛋白的表达变化;Annexin V-PE/7-AAD染色后经流式细胞术检测细胞凋亡率,观察3-MA抑制自噬对RSV诱导凋亡的影响。2.2 RSV感染Hep2-sh-Atg5,Hep2-sh-Beclin1稳转细胞株48 h,与Hep2-sh-luciferase比较,Western blot检测full length casepase 3,cleaved-casepase 3,PARP,cleaved-PARP蛋白的表达变化,观察干扰上述基因表达抑制自噬对RSV诱导凋亡的影响。2.3 Atg5 si RNA或Beclin1 si RNA转染Hep2细胞24 h,RSV再感染48 h,与Negtive control si RNA转染的对照细胞比较,FITC-Annexin V/PI染色后经流式细胞术检测细胞凋亡率。2.4 1m M 3-MA预处理Hep2细胞2 h后,RSV再感染,于病毒吸附2h后,在3-MA处理孔中加入50μM凋亡抑制剂Z-VAD-FMK,继续感染至48 h,Western blot检测RSV F蛋白的表达变化;同时收集细胞上清进行病毒滴定。探讨凋亡抑制剂Z-VAD-FMK是否可逆转3-MA抑制自噬对病毒复制造成的影响。2.5 RSV感染Hep2-sh-Atg5和Hep2-sh-Beclin细胞,病毒吸附2 h后,分别加入50μM广谱凋亡抑制剂Z-VAD-FMK,继续感染至48 h,Western blot检测RSV F蛋白的表达变化;同时收集细胞上清进行病毒滴定。探讨凋亡抑制剂Z-VAD-FMK是否可逆转敲低自噬相关基因抑制自噬对病毒复制造成的影响。结果:1促进自噬有助于病毒复制;抑制自噬不利于病毒复制1.1经过系列相关实验,确定自噬诱导剂rapamycin和自噬抑制剂3-MA或wortmannin的最佳作用浓度并验证其效果。它们的最佳作用浓度分别为:100 n M,1 m M和100 n M。1.2与RSV单独感染比较,100 n M rapamycin处理可显著增加胞内病毒M、N、L、G、F、M2、NS1基因的表达水平(P0.05);显著增加RSV F蛋白的表达(P0.05);显著增加细胞上清病毒滴度(P0.05)。1 m M 3-MA或100 n M wortmannin处理细胞,结果与之相反。1.3成功建立干扰Atg5,Atg7,Beclin 1的稳定细胞系Hep2-sh-Atg5,Hep2-sh-Atg7和Hep2-sh-Beclin 1和干扰luciferase的对照细胞系Hep2-sh-luciferase,经Western blot验证,干扰效果明显;功能验证结果显示:干扰上述基因可明显抑制RSV诱导的自噬。1.4干扰Atg5、Atg7和Beclin 1基因表达抑制自噬不利于RSV复制与Hep2-sh-luciferase细胞比较,RSV感染Atg5、Atg7和Beclin敲低表达的Hep2细胞,可显著降低胞内病毒M、N、L、G、F、M2、NS1基因的表达水平(P0.05);显著降低RSV F蛋白的表达(P0.05);显著降低细胞上清病毒滴度(P0.05)。2抑制自噬使RSV诱导的细胞凋亡明显增加2.1与RSV单独感染组比较,3-MA处理组cleaved-casepase 3及cleaved-PARP的表达水平显著提高(P0.05);凋亡率显著提高(P0.05)。2.2与Hep2-sh-luciferase对照细胞比较,RSV感染的Hep2-sh-Atg5或Hep2-sh-Beclin 1细胞cleaved-casepase 3及cleaved-PARP表达水平显著提高(P0.05);2.3经FITC-Annexin V/PI染色,流式细胞术检测显示:si RNA转染Hep2细胞敲低Atg5或Beclin1的表达可致RSV诱导的细胞凋亡率明显提高(P0.05)。3凋亡抑制剂Z-VAD-FMK可部分逆转因自噬抑制所引起的病毒复制降低,提示自噬通过抑制细胞凋亡而助于病毒复制。3.1与3-MA单独处理组比较,Z-VAD-FMK和3-MA联合处理组RSV感染Hep2细胞的RSV F蛋白的表达和细胞上清病毒滴度明显提高(P0.05)。3.2 RSV感染Hep2-sh-Atg5、Hep2-sh-Beclin 1细胞,经Z-VAD-FMK处理,RSV F蛋白的表达和细胞上清病毒滴度与单独RSV感染组比较明显升高(P0.05)。凋亡抑制剂Z-VAD-FMK可部分逆转因自噬抑制所引起的病毒复制降低,提示自噬通过抑制细胞凋亡而助于病毒复制。结论:1 RSV感染可诱导Hep2细胞完全的自噬流反应。2 RSV感染可诱导Balb/c鼠肺组织自噬水平增高。3 RSV通过ROS依赖的AMPK-m TOR通路活化诱导Hep2细胞自噬。4 RSV利用细胞自噬抑制细胞凋亡进而促病毒自身复制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

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