神经保护药物TBN在缺血脑卒中大鼠模型中的药效与作用机理研究

发布时间：2018-01-20 22:33

  本文关键词： 缺血性脑卒中 自由基 氧化损伤 药效学研究 神经修复 细胞凋亡　出处：《暨南大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的参照CFDA、FDA和STAIR有关脑卒中药物药效学研究相关技术指导原则,在SD大鼠永久性缺血脑卒中模型、缺血再灌注脑卒中模型以及全脑缺血脑卒中模型中系统规范的研究TBN的药效学作用,并在永久性缺血脑卒中模型中对TBN的保护作用机理进行深入研究,为TBN进入临床试验提供实验基础;同时,通过完成TBN药效学研究,在本实验室建立起系统规范的脑卒中药物临床前药效学研究体系,用于其它脑卒中药物的药效学研究。方法1.应用激光多普勒血流仪监测SD大鼠损伤侧大脑中动脉供血区血流量变化,建立永久性缺血脑卒中模型,结合实验过程中大鼠体重、体温、血气等生理指标的监测,以Neurological severity score行为学变化和脑梗死面积为主要观察指标,系统的研究TBN在永久性缺血脑卒中模型中的量效关系、治疗时间窗、药效学作用以及不同给药方式的药效学作用。2.应用线栓法栓塞大鼠大脑中动脉,建立缺血再灌注脑卒中模型,术后静脉推注给予受试化合物TBN,联合实验过程中脑血流量、血气、心率、血压、体重、体温等生理参数的监测,以大鼠Rotarod、Longa以及Neurological severity score三种行为学指标和脑梗死面积为主要指标,研究TBN在缺血再灌注脑卒中大鼠中的药效学作用;3.通过结扎SD大鼠双侧颈总动脉,建立全脑缺血脑卒中模型,术后7天一天2次静脉注射给予30 mg/kg的受试化合物TBN,以Y迷宫、新物体识别、步态分析主要指标,联合脑血流量、血气、体重、体温等生理参数的监测,研究TBN在全脑缺血脑卒中大鼠中的长期药效学作用;4.应用HE染色、免疫组化、Western blot等技术,探讨TBN保护缺血脑卒中损伤的可能作用机理,为阐明TBN的药效学提供理论基础。结果1.在sd永久性缺血脑卒中大鼠模型中,实验前和实验结束时称量记录大鼠体重,各组之间大鼠体重在术后均显著降低,但组间未见统计学差异,说明在该实验中tbn对永久缺血性脑卒中大鼠的体重没有影响。实验采用neurologicalseverityscore法分别在大脑中动脉栓塞后3h和24h对各组大鼠进行行为学评价,实验结果显示:tbn可以有效的改善缺血大鼠的行为、感觉、平衡、反射功能;缺血24h后,脑组织切片染色可见10mg/kg的tbn、30mg/kg的tbn、90mg/kg的tbn均能显著减小大鼠的脑梗死面积,保护率分别为16.64%、14.50%和22.82%。在tbn量效关系研究中,tbn最低起效剂量为10mg/kg。在tbn治疗时间窗研究中,tbn治疗时间窗可达6h。在tbn给药方式研究中,tbn静脉连续给药药效学作用优于tbn静脉推注给药药效学作用。2.在sd大鼠缺血再灌注脑卒中模型中,实验采用rotarod法、longa法以及neurologicalseverityscore三种方法分别对各组大鼠进行行为学评价。rotarod法结果显示,10mg/kg的tbn和90mg/kg的tbn在实验第9天时均可以显著的提高缺血大鼠在转棒上的滞留时间,其中90mg/kg的tbn治疗作用与edaravone效能相近,而川芎嗪无明显改善作用;longa法结果显示,30mg/kg的tbn和90mg/kg的tbn可以有效的改善缺血大鼠行为学缺失症状;neurologicalseverityscore法证明10、30、90mg/kg的tbn在实验第9天可以有效的综合改善缺血大鼠的行为、感觉、平衡、反射功能,其中90mg/kg的tbn从实验第3天开始就能显著改善脑卒中动物neurologicalseverityscore。脑梗死染色可见低、中、高剂量的tbn均能显著减小大鼠的脑梗死体积,其保护率分别为21.7%、31.3%、36.3%。10mg/kg的tbn保护作用与85mg/kg的tmp·hcl保护作用相当(与90mg/kg等摩尔浓度),90mg/kg的tbn保护作用和edaravone6mg/kg保护作用相当,但edaravone6mg/kg剂量是临床使用剂量的13倍。3.在全脑缺血脑卒中模型中,tbn给药一周后,实验采用y迷宫、新物体识别、步态分析对大鼠的学习记忆以及运动功能进行评价,实验连续观察6周。结果可见,无论是在y迷宫实验中,还是在新物体实验中,tbn均能提高全脑缺血脑卒中大鼠的学习记忆能力,药效与临床一线用药Memantine药效相当;而在步态分析中,模型组大鼠与假手术组大鼠相比,未见统计学差异,TBN组与模型组相比也未见统计学差异;在病理学研究中,TBN可以显著的增加全脑缺血脑卒中大鼠神经元细胞数目,并能保护神经纤维的损伤。4.TBN作用机理研究结果可见,在缺血24 h永久性缺血脑卒中模型中,90 mg/kg的TBN可以显著的降低脑卒中大鼠氧化损伤指标4-HNE和8-OHd G的表达,增加永久性缺血脑卒中大鼠半影区神经细胞数目,降低神经胶质细胞数目。Western blot结果显示TBN可以通过上调p-Akt通路,从而上调Bcl-2、下调Bax、抑制Cyt C释放、降低Caspase-3和cleaved caspase-3蛋白的表达,从而抑制神经细胞凋亡;TBN可以上调PSDS95、CNPase、MEF2C蛋白的表达,降低脑卒中大鼠神经细胞轴突和突触的损伤;TBN还可以通过促进VEGF和MEF2C蛋白的表达,保护半影区脑实质内的微小血管。在正常大鼠皮层神经细胞线粒体实验中,TBN可以降低抗霉素A诱导的线粒体内自由基的产生以及自由基对线粒体膜脂质氧化损伤,并能显著抑制CaCl2诱导的线粒体肿胀。结论1.TBN在永久性缺血脑卒中大鼠、缺血再灌注脑卒中大鼠、全脑缺血脑卒中大鼠中均能显著的改善神经行为学功能缺损,并能显著降低脑梗死面积或保护神经原细胞损伤,其药效优于临床上使用的依达拉奉和川芎嗪。TBN最低起效剂量为10 mg/kg,治疗时间窗为6 h。2.TBN可以清除线粒体内自由基和抑制线粒体内钙超载,并且可通过调控线粒体凋亡通路和MEF2C通路抑制细胞凋亡,保护神经细胞损伤;TBN通过上调PSDS95、CNPase、MEF2C蛋白表达,降低脑卒中大鼠神经细胞轴突和突触的损伤;TBN通过上调VEGF和MEF2C蛋白表达,保护缺血脑卒中半影区脑实质内微小穿支血管。
[Abstract]:Objective To study the pharmacodynamic effects of TBN in cerebral artery of SD rats and to establish a permanent ischemic stroke model . The experimental results showed that tbn of 10 mg / kg and tbn of 90 mg / kg could significantly improve the cerebral infarction area in rats . Conclusion 1 . TBN can significantly improve neurobehavioral deficits in rats with cerebral ischemic stroke , ischemia - reperfusion stroke rats and whole cerebral ischemic stroke .

【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5;R-332
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本文编号：1449625