基于鞭毛蛋白佐剂的鼠疫炭疽联合疫苗初步研究

发布时间：2018-01-25 01:21

本文关键词： 鞭毛蛋白重组鼠疫抗原鼠疫炭疽联合疫苗 F1抗原表位　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：鼠疫和炭疽均属于自然疫源性烈性传染病,严重威胁着人类的健康安全。这两类疾病的病原体鼠疫耶尔森氏菌和炭疽芽胞杆菌均被美国列为反恐重点病原体,最高优先级A类病原体。此外,我国存在大范围的鼠疫和炭疽的高发地,近年来国内鼠疫、炭疽疫情时有发生。不论平时、战时我国都有同时面对鼠疫和炭疽威胁的风险。因此,对鼠疫和炭疽疫苗的研究兼顾军用与民用,具有重要意义。尤其是近年来,抗生素的大量使用导致耐药菌株出现后,使得对鼠疫和炭疽的预防显得更加重要。本研究利用鞭毛蛋白作为疫苗的佐剂,以鼠疫耶尔森氏菌的保护性抗原F1和V,以及位于炭疽芽胞杆菌保护性抗原PA结构域2的中和性表位2β2-2β3loop区作为疫苗的有效成分来研究鼠疫炭疽联合疫苗的可行性。鞭毛蛋白是一种Toll样受体5(TLR5)的配体,通过刺激细胞因子的产生和树突细胞的成熟而将先天性免疫和适应性免疫联系起来而发挥佐剂功能,完整的鞭毛蛋白或其片段均可作为佐剂,包括作为黏膜佐剂,基于鞭毛蛋白佐剂的疫苗仅需较低剂量即可激起有效的免疫反应,而且在老龄免疫系统中鞭毛蛋白仍具有佐剂活性。鉴于鞭毛蛋白作为疫苗佐剂的一系列优势,构建基于鞭毛蛋白佐剂的重组鼠疫抗原、炭疽表位重组蛋白和鼠疫炭疽重组融合蛋白。在评价重组鼠疫抗原和炭疽表位重组蛋白的基础上,初步探讨鼠疫炭疽联合疫苗的免疫反应机制,同时评价鞭毛蛋白作为疫苗佐剂的效果。本研究首先通过基因重组对F1抗原进行了突变,得到了F1mut突变体,该突变体中F1单体形成的凹槽可以封闭自身的N端,形成分子内互补,使得F1以单体形式存在,不易发生聚集。在F1mut的C端融合V抗原,将构建好的F1mut-V克隆至缺失了186-397位氨基酸的鞭毛蛋白的185位氨基酸的C端,得到Fli Cdel-F1mut-V重组鼠疫抗原。通过Western blotting验证重组鼠疫抗原的成功表达以及与F1和V单抗的结合能力。在小鼠模型上进行了免疫原性和免疫保护评价。免疫小鼠的血清学检测结果显示Fli Cdel-F1mut-V在小鼠体内诱导高效价的抗F1和抗V的特异性抗体;攻毒实验结果显示以鞭毛蛋白为佐剂的重组鼠疫抗原Fli Cdel-F1mut-V免疫小鼠后,完全保护小鼠抵抗104 CFU鼠疫标准强毒株141株的攻击。在对抗生物恐怖时,往往需要同时应对多种烈性病原体。研制多种烈性病原体的联合疫苗能够同时预防两种或两种以上的疾病,大大减少免疫次数,节省卫生资源。此外,联合疫苗的应用不论在战时还是平时都可以增加接种者,特别是儿童的依从性。本研究开展了基于鞭毛蛋白佐剂的鼠疫炭疽联合疫苗的探索研究。实验室前期的工作证明了2β2-2β3loop区为炭疽保护性抗原PA重要的中和性表位区域。本研究构建了基于鞭毛蛋白佐剂的鼠疫炭疽重组融合蛋白Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2及炭疽表位重组蛋白Fli Cdel-PAloop2。通过Western blotting验证Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2的成功表达,通过Dot blotting和ELISA鉴定Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2与PA结构域2特异性单抗的结合能力。在免疫大鼠的血清学检测中,Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2均诱导产生PA的特异性抗体,但抗体水平较r PA诱导的抗体水平低;而Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2组诱导产生的PA特异性抗体整体低于Fli Cdel-PAloop2组,这可能与2β2-2β3loop区在重组蛋白折叠过程中其功能区被遮盖,使得诱导机体产生抗体的能力下降所致,也可能是Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2各组分之间会因物理化学性质的不同而产生影响。大鼠模型上使用氢氧化铝佐剂的Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2与未使用佐剂Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2刺激产生的PA特异性抗体水平之间无显著性差异,而其中无佐剂的Fli Cdel-PAloop2诱导产生的PA特异性抗体水平仅次于r PA免疫组,提示Fli Cdel本身就是一种良好的佐剂。在小鼠模型上检测到Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2能够诱导产生PA中和抗体,但中和抗体的水平低于r PA免疫组,而且产生中和抗体的小鼠在注射炭疽毒素后生存时间得到延长。这提示仅依靠PA结构域2的2β2-2β3loop一个表位,代替完整PA是不够的,还需要其他中和性表位的同时存在。另外,在小鼠模型上,Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2的免疫血清中检测出较高水平的F1和V特异性抗体。为了避免在联合疫苗中大分子蛋白在结构上对小分子蛋白或者表位的遮盖,从而影响各组分的效力,应用抗原的中和性表位代替完整抗原就可以促进联合疫苗的合理设计。本研究利用鼠疫菌F1抗原的中和性单克隆抗体F2H5对噬菌体展示随机12肽库进行了筛选,得到两株能与F1抗原竞争结合F2H5抗体的噬菌体单克隆,其肽序列为:FIPEVRDPRYHP和MTLDLPDLRYGF。然而这两个肽序列与F1抗原经序列比对,并无一致性序列存在。此后,将筛选到的肽序列与Fli Cdel通过基因重组,得到重组蛋白Fli Cdel-F1候选表位。重组蛋白在Western blotting分析和ELISA分析结果中,均显示可以被F1单克隆抗体识别,认为筛选到的肽序列为F2H5的模拟表位。F1表位的研究还只是的初步探索,其有效性尚需大量实验进一步验证。综上所述,本研究应用了一个良好的疫苗佐剂Fli Cdel,构建了基于鞭毛蛋白的重组鼠疫抗原Fli Cdel-F1mut-V,在小鼠模型上证实了Fli Cdel-F1mut-V良好的免疫保护性,该重组鼠疫抗原具有良好的应用前景。此外,构建了基于鞭毛蛋白的炭疽表位重组蛋白Fli Cdel-PAloop2和鼠疫炭疽联合疫苗Fli Cdel-F1mut-VPAloop2,在大鼠和小鼠模型上分别诱导产生了体液免疫反应,延长了炭疽毒素攻击小鼠的存活时间;在大鼠模型上证实了鞭毛蛋白的佐剂作用。此外,还筛选到了两个F1抗原的模拟表位,为研究鼠疫表位疫苗打下了一定基础。
[Abstract]:In this study , we study the feasibility of using flagellin as adjuvant of vaccine adjuvant , and it is very important to study the immune response mechanism of plague and anthrax . Fli Cdel - PAloop2 and Fli Cdel - F1mut - V - PAloop2 were induced to produce PA neutralizing antibodies . In addition , the mimic epitope of two F1 antigens has been screened , which lays a foundation for the study of plague epitope vaccines .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392

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