基于表位定向哺乳动物细胞抗体库筛选新型抗PD-1抗体

发布时间：2018-02-03 23:02

本文关键词： 哺乳动物细胞抗体库计算机辅助分子设计 PD-1 FV78　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：抗体药物是现代生物医药产业的主力军,其临床应用从最初的抗移植排斥逐步拓展至肿瘤、自身免疫疾病、抗感染、心脑血管疾病、眼科用药以及生物安全防控等重大领域。治疗性抗体的发展经历了多克隆抗血清、鼠源单克隆抗体、人源化抗体以及全人抗体四个阶段。人源化以及全人抗体是抗体药物发展的主流和趋势。在人-人杂交瘤技术、转基因小鼠、抗体库技术以及EB病毒转化人B淋巴细胞等全人抗体制备技术中,抗体库技术是目前最为常用的技术之一。噬菌体抗体库技术是目前抗体研发最广泛使用的技术。阿达木单抗(修美乐)是该技术平台下筛选获批的首个全人源单抗药物,并且连续几年(2012-2015)蝉联全球畅销药物排行榜之首。但是,与目前抗体药物规模化生产常用的哺乳动物细胞表达体系相比,噬菌体使用的原核表达系统缺乏精细的蛋白质折叠和修饰过程,从中筛选获得的抗体往往不能反映天然抗体的构象和翻译后修饰水平。因此,利用哺乳动物细胞系统展示天然构象和翻译后修饰的抗体具有实际的应用价值和前景。但是,受制于转染效率、培养体系等因素,哺乳动物细胞抗体库往往库容量较小(约106),限制了其广泛应用。计算机辅助分子设计是近年来抗体优化筛选的一个新兴技术,利用计算机辅助分子设计针对特异性抗原表位设计人工抗体库,能在一定程度上提高抗体库中功能性抗体以及高亲和力抗体的比例。因此,利用计算机辅助分子设计结合哺乳动物细胞展示系统有助于在有限的抗体库容基础上,优化抗体库质量,提高抗体库筛选效率。肿瘤免疫治疗经历了漫长的探索和重大的挫折之后逐渐显现出良好的治疗效果并有望改变目前肿瘤的治疗策略。针对CTLA-4、PD-1/PD-L1等“免疫卡控点分子”的单抗拮抗剂以及基于抗体结构设计的新型CART技术在肿瘤免疫治疗领域突破性的疗效奠定了抗体在该领域的重要地位。程序性死亡受体-1(PD-1)是一类重要的免疫负性调控分子(也称“免疫卡控点分子”),主要在激活的T细胞和B细胞中表达,通过与NK等细胞表面的PD-L1以及PD-L2配体结合,激活负调控信号,抑制免疫细胞的过度活化。大量的研究显示,多种肿瘤细胞表面高表达PD-L1分子,通过PD-1/pd-l1信号通路形成机体免疫耐受,逃避机体的免疫反应;特异性阻断pd-1/pd-l1信号通路,可以有效激活免疫系统杀伤肿瘤细胞。因此,pd-1/pd-l1成为肿瘤免疫治疗的热门靶标。国外制药巨头针对pd-1分子单抗药物研发展开了激烈的竞争,其中bms公司研发的nivolumab抗体获fda上市批准,应用于转移性恶性黑色素瘤、鳞状非小细胞肺癌、肾癌等多个肿瘤的临床治疗;除了单药使用外,nivolumab与其他靶向药物联合使用的临床试验正在开展,并取得良好的进展。但是,目前国内只有两家企业生产的pd-1抗体获得临床批文。因此,筛选具有自主知识产权的新型pd-1抗体具有重要的理论和实际意义。本论文构建了哺乳动物细胞展示系统,并以pd-1为靶点,借助计算机辅助分子设计设计获得了靶向pd-1抗体库,结合流式高通量筛选候选抗体;进一步建立体内外评价模型,合理评价候选抗体生物学活性。具体研究结果如下:1、哺乳动物细胞展示系统的构建及验证为了实现抗体在哺乳动物细胞表面展示、单一细胞表达单一抗体基因等抗体库筛选的基本原则,我们在frt-flp-in?定点整合系统的基础上,构建了抗体fab结构域膜表达载体pfrt/kigg1fabhtm;同时构建了全长抗体表达载体prt/kigg1,可实现与抗体库中筛选获得候选抗体进行快速对接表达。流式细胞以及激光共聚焦等实验显示,pfrt/kigg1fabhtm载体能够实现fab抗体在哺乳动物细胞膜表面展示。抗埃博拉病毒抗体、抗西尼罗河病毒抗体、抗pd-1抗体以及抗cd3抗体等多个抗体的瞬时表达结果结果显示,各抗体在全长抗体表达载体prt/kigg1上的瞬时表达量可达100μg/ml;利用该系统构建了抗pd-1抗体、抗cd3抗体等多个抗体稳定表达细胞株,规模化流加培养14天后抗体的表达量可达1.2g/l。提示,prt/kigg1载体是一套通用、高效的全长抗体表达载体。进一步,我们利用红、绿荧光蛋白验证frt-flp-in?体系是否能实现单一细胞表达单一抗体基因。研究结果显示,frt-flp-in?稳定转染体系下,每个细胞均只表达一种荧光蛋白基因;表明frt-flp-in?定点整合系统能够实现单个细胞表达单一目的基因。借助构建的哺乳动物表面展示系统,将抗pd-1阳性抗体mil75的fab结构域展示在cho表面,流式分析结果显示,pd-1-fitc与细胞的结合呈剂量依赖性,提示该展示系统可以借助facs实现高通量筛选。2、靶向pd-1抗体库构建及筛选利用分子模拟与对接搭建pd-1与pd-l1复合物空间结构,根据pd-l1与pd-1相互作用模式分析获得pd-l1参与识别pd-1分子关键氨基酸残基。进一步选用nivolumab抗体轻、重链可变区归属亚组(igkv3-11*01、ighv3-33*01)所对应的通用序列为模板进行合成抗体库的设计,在抗体模板可及性表面积较大的残基位点上引入一些与pd-l1关键残基理化性质相近的氨基酸突变,获得与pd-l1识别pd-1作用模式类似的靶向抗体库。借助前期构建的哺乳动物细胞展示平台,构建抗pd-1靶向抗体库,转化子计数和二代高通量测序结果显示,抗体库涵盖了轻链及大部分重链理论序列(实测序列多样性vs理论设计序列多样性,轻链96/96;重链7321/8640)的多样性。进一步利用流式分选技术对构建的细胞库进行3轮富集筛选,获得阳性克隆并进行测序获得候选抗体序列。对候选抗体序列进行序列比对分析,按照序列同源性以及主链碳原子均方根位移等参数将所测120个抗体序列分为10组,并从中筛选13个代表性序列。将13个代表性的抗体序列进行全长抗体表达,表达量结果提示13株抗体均具有较高表达水平(15.2μg/ml~74.5μg/ml)。其中fv63(59μg/ml)、fv78(74.5μg/ml)表达量明显高于对照抗体mil75(28.7μg/ml)。特异性结合活性实验进一步筛选获得5株亲和力较好的抗体(1-4×10-10m)。借助生物信息学、结构生物学以及计算机辅助分子模拟技术对筛选获得的一系列抗体进行抗体空间结构稳定能、识别pd-1分子空间表位等进行理论评估,最终确定了两株的功能活性较好的候选抗体fv74、fv78。初步结果显示fv78表达量优于上市抗体mil75。3、靶向pd-1新抗体fv78生物学活性评价进一步对靶向pd-1新抗体fv78开展体内、外功能评价。实验结果显示,fv78特异性识别人pd-1分子,并与cd28家族其它成员(cd28、ctla4、btla、icos)不交叉;竞争elisa实验结果提示fv78能够有效阻断pd-1与pdl1或pdl2之间相互作用,半数效应浓度均为9.9μg/ml。体外pbmc活化模型以及dc-cd4+t混合淋巴培养实验模型中,fv78抗体能够有效激活t细胞释放ifn-γ。利用人外周血pbmc回输免疫缺陷型小鼠npg,构建移植物抗宿主疾病模型(gvhd),合理评价抗PD-1抗体的免疫激活活性。结果显示,给予FV78抗体可以有效激活免疫系统,加重GVHD反应,加速小鼠死亡(MST,FV78 vs N.S=36 vs 41 days,P0.05);相对于阳性对照MIL75组,FV78抗体具有一定优效性(MST,FV78 vs MIL75=36 vs 39days,P=0.08)。综合体内外实验结果提示,靶向PD1新抗体FV78具有不弱于阳性抗体MIL75的体内外生物学活性。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392.11

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