APOBEC3B抑制HBV复制的分子机制

发布时间：2018-02-04 02:35

本文关键词： 乙型肝炎病毒 APOBEC3B 逆转录脱氨基作用　出处：《重庆医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:HBV病毒是一种嗜肝DNA病毒,以逆转录方式进行复制。APOBEC3B是一种天然免疫分子,具有清除外源病毒或内源转座子的能力,在宿主的防御过程中起着重要的作用。最近研究报道表明APOBEC3B能对HBV ccc DNA进行脱氨基作用,氨基化的ccc DNA通过UNG家族蛋白所介导的BER修复途径降解。由于APOBEC3B是细胞内的穿梭蛋白,除了在核内作用于ccc DNA外,APOBEC3B能否在HBV复制的逆转录环节发挥抑制作用尚不清楚。因此,本文重点研究了宿主限制性因子APOBC3B在逆转录过程中抑制HBV复制的分子机制,其研究结果有助于进一步阐明APOBC3B抑制HBV的分子机制,并以此为靶点筛选新的抗病毒药物。方法:(1)APOBEC3B抑制HBV复制的表型和功能研究:利用HBV转染-复制系统,在Hep G2.0细胞中共转染外源表达APOBEC3B和HBV A、B、C、D四种不同基因型表达质粒,Southern blot检测了APOBEC3B对四种HBV四种基因型的抑制作用;研究了APOBEC3B对HBV基因型D相关复制参数的检测:ELISA检测了细胞上清中HBs Ag表达水平,q PCR检测了HBV核心颗粒DNA和ccc DNA的表达水平;应用定点突变技术构建了APOBEC3B羧基端脱氨酶活性位点H253R突变体,ELISA检测了细胞上清中HBs Ag的恢复情况、q PCR检测了Core DNA的水平变化,Southern blot验证了APOBEC3B羧基端的抗病毒作用,3D PCR和克隆测序研究了APOBEC3B对HBV病毒颗粒DNA发生的脱氨基作用;根据APOBEC3B羧基端的三维结构,构建了羧基端活性中心附近的三个螺旋区段(α2,α3,α4)的缺失突变体和α4螺旋区内(D316A,K320A,E321A,R327A,D328A)位点的突变体,Southern blot筛选了参与APOBEC3B抑制HBV复制的重要区段和关键位点,3D PCR和克隆测序进行了验证。进一步研究了APOBEC3B对病毒在逆转录环节形成的复制中间体(包括病毒DNA和RNA)的脱氨基作用进行分析:Southern blot验证了HBV聚合酶突变体YMHA和RNAse H酶突变体D702A突变体构建成功,3D-PCR和克隆测序研究了APOBEC3B对HBV逆转录复制环节中的病毒颗粒负链DNA、正链DNA和pg RNA发生的脱氨基作用。(2)APOBEC3B在逆转录环节与病毒蛋白相互作用抑制HBV复制的机制研究:首先免疫荧光试验检测了APOBEC3B的细胞内定位,超速离心提取HBV病毒颗粒检测了APOBEC3B在细胞浆中病毒颗粒内的表达,提取细胞核浆蛋白分析了APOBEC3B的核浆分布;然后分析了APOBEC3B与病毒蛋白的相互作用:免疫共沉淀试验检测了APOBEC3B与HBV Core蛋白和P蛋白的相互作用,并用RNase A处理分析这种作用是否依赖于RNA,根据APOBEC3B的结构域构建了APOBEC3B的五个区段缺失突变体(△10-65AA、△66-100AA、△124-194AA、△253-284AA、△289-373AA),免疫共沉淀检测了APOBEC3B与P蛋白的结合区段,Southern blot检测了此区段的抗病毒作用。结果:(1)APOBEC3B抑制HBV复制的表型和功能研究:Hep G2.0细胞中过表达外源的APOBC3B明显对细胞无毒性;APOBEC3B能够显著抑制HBV A、B、C、D四种HBV基因型的复制;APOBEC3B显著抑制HBV基因型D上清中HBs Ag、病毒颗粒DNA和ccc DNA表达水平;APOBEC3B羧基端脱氨酶活性位点H253位点突变后,丧失了对病毒DNA的抑制作用,表明APOBC3B依赖于脱氨酶方式抑制病毒复制,同时H253位点是APOBEC3B重要的脱氨酶活性和抗病毒活性位点,进一步通过3D PCR和克隆测序表明APOBEC3B对HBV核心颗粒中的DNA诱导了大量的G-A突变,这种G-A突变主要以5’-Gp A-3’的二联核苷酸的形式;最后通过Southern blot和3D-PCR筛选APOBEC3B羧基端脱氨酶活性中心的结构域表明α3和α4螺旋区缺失后,其抗病毒活性消失,并且α4区域的D316位点突变后,APOBEC3B的脱氨酶活性和抗病毒活性消失;APOBEC3B对HBV负链DNA发生编辑作用,形成大量的G-A突变,对HBV正链DNA进行编辑作用,形成少量的C-T突变,H253脱氨酶活性位点突变后,这种编辑形成的突变消失;APOBEC3B主要作用于HBV负链DNA的X区段,具有序列特异性;APOBCE3B对病毒pg RNA不发挥编辑作用。(2)APOBEC3B在逆转录环节与病毒蛋白相互作用抑制HBV复制的机制研究:细胞组分定位分析表明APOBEC3B大部分分布于细胞核,少量分布于细胞质,核定位信号区突变后,APOBC3B位于细胞质中,并通过依赖于脱氨酶方式抑制HBV复制;免疫共沉淀表明APOBEC3B与HBV核心蛋白Core发生相互结合作用,并且这种结合依赖RNA;APOBEC3B与HBV聚合酶P发生相互结合作用,且APOBEC3B蛋白氨基端的(124AA-194AA残基)是APOBEC3B与HBV P蛋白发生相互作用的重要区段。结论:APOBEC3B是一种天然抗病毒免疫因子,能够通过脱氨基作用抑制HBV复制;羧基端D316位点是APOBEC3B脱氨酶和抗病毒的关键位点;APOBEC3B可以与HBV Core蛋白相互结合促进APOBEC3B包装进入病毒颗粒,在HBV逆转录过程中结合pg RNA和HBV P蛋白,然后编辑病毒的负链DNA和正链DNA,发生脱氨基作用,促进了HBV DNA的降解。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373.21

【参考文献】