硫化氢和脂氧素A4对不同炎症模型的免疫调控机制研究

发布时间：2018-02-15 02:48

  本文关键词： 硫化氢 先兆子痫 调控性T细胞 Th17细胞 树突状细胞 脂氧素A4 DSS 急性肠炎 B1O细胞 CX3CR1 巨噬细胞 脂氧素A4 脓毒血症 GM-CSF B细胞 巨噬细胞 STAT5　出处：《华中科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分 硫化氢在低剂量LPS诱导的先兆子痫小鼠模型中的免疫调控机制研究目的：先兆子痫(PE)是妊娠过程中的一种涉及多系统的综合症。异常的母体免疫反应和炎症被涉及到先兆子痫的发生发展过程中。硫化氢(H2S)是一种内源性的气体递质,具有抗炎和免疫调控特性。本课题旨在探讨在LPS诱导的先兆子痫小鼠模型中H2S发挥抗炎及保护胎儿作用的免疫调控机制,从而为H2S临床治疗先兆子痫拓宽视野并奠定理论基础。方法：采用低剂量LPS诱导小鼠先兆子痫,用ELISA法检测小鼠血清TNF-α、 IL-6和IL-10的含量,用流式细胞术检测小鼠脾脏及引流子宫的腹主动脉旁淋巴结的检测不同组小鼠CD4+Toxp3+ Treg细胞、CD4+IL-17+ Th17细胞、CD11c+ CD80+ DCs的比例,用real-time PCR法检测小鼠脾脏CBS和CSE、脾脏和腹主动脉旁淋巴结Foxp3、Tet1及Tet2,小鼠腹主动脉旁淋巴结的表达。结果：1.LPS组小鼠血清TNF-a和IL-6含量明显高于Control组,IL-10明显低于Control组,胎鼠重量明显低于Control组,而H2S供体NaHS治疗后明显改善了LPS的效应：2.LPS组小鼠脾脏CSE表达明显低于Control组,CBS的表达两组之间无明显差异;3.LPS组小鼠脾脏和腹主动脉旁淋巴结中CD4+ Foxp3+ Treg细胞的比例及Foxp3、Tetl的表达均低于Control组,而LPS+NaHS组CD4+Foxp3+ Treg细胞的比例及Foxp3、Tetl的表达均显著高于LPS组;Tet2的表达在小鼠脾脏和腹主动脉旁淋巴结中的表达三组之间均无显著性差异；4.LPS组小鼠脾脏和腹主动脉旁淋巴结中CD4+IL-17+ Th17细胞的比例及IL-17A和RORyt的表达均高于Control组,而LPS+NaHS组CD4+L-17+ Th17细胞的比例在脾脏与LPS组无显著性差异,在腹主动脉旁淋巴结明显低于LPS组,IL-17A和RORyt的表达在腹主动脉旁淋巴结均显著低于LPS组：5.小鼠脾脏CD11c+ CD80+ DCs的比例LPS组高于Control组和LPS+NaHS组。结论：1.H2S供体NaHS减轻低剂量LPS诱导先兆子痫模型中的系统性炎症,并且缓解胎儿宫内发育迟缓；2.NaHS促进Treg细胞扩增,减少Th17细胞,维持DCs在不成熟状态,从而发挥保护作用;3.NaHS促进Treg细胞增加与上调Tet1的表达相关。第二部分 脂氧素A4在DSS诱导的急性肠炎小鼠模型中的免疫调控机制研究目的：炎症性肠病(IBD)是一类至今病因及发病机制尚不明确的肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。目前认为免疫异常在IBD的发生发展中起关键性作用。有报道一群分泌IL-10的调控B细胞(B10)可抑制DSS诱导的肠炎。另外有报道发现在肠道炎症过程中,从血单核细胞来源的CX3CR1+巨噬细胞进入肠道后功能发生改变,从而破环了肠道稳态。脂氧素A4(LXA4)是一种内源性花生四烯酸的代谢产物,在炎症中发挥着抗炎及促炎症解决的作用。本研究通过建立DSS诱导的急性肠炎模型系统探讨了LXA4保护肠炎过程中对B细胞及CX3CR1+巨噬细胞的免疫调控作用,为LXA4治疗IBD提供新的理论依据。方法：1.采用小鼠饮用3.5%DSS溶液连续7天建立DSS诱导的急性肠炎模型,同时每天给予腹腔注射LXA4 (10μg/kg)治疗,记录体重并进行DAI评分及病理组织学分级,用ELISA法检测结肠组织LXA4及IL-6、TNF-α、IL-1β和IFN-γ的含量,用real-time PCR检测结肠组织5-LOX及IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ及iNOS mRNA的表达量。2.用磁珠分选法纯化正常小鼠脾脏CD19+B细胞,用RT-PCR检测脾脏及纯化的CD19+B细胞上的ALX/FPR2。3.建立DSS诱导的急性肠炎模型的第1天开始每天给予LXA4治疗,取小鼠第3、5、7天的脾脏细胞用LPS (10μg/ml)、PMA(50ng/ml)、ionomycin (750ng/ml)和monensin (2μM)体外诱导5小时,用流式细胞术检测B10细胞的比例：第8天用real-time PCR检测脾脏纯化的CD19+B细胞IL-10和GM-CSF mRNA表达量。4.脾脏切除术后小鼠饮用3.5%DSS溶液连续7天,同时每天给予腹腔注射LXA4 (10μg/kg)治疗,进行DAI评分,用real-time PCR检测结肠组织IL-6、TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA的表达量。5.用FITC标记葡聚糖检测腹腔巨噬细胞的吞噬功能。6.免疫组织化学检测肠道固有层CD68+细胞,流式细胞术检测外周血Ly6C+细胞、肠道固有层和肠系膜淋巴结中CX3CR1+细胞的比例及肠系膜淋巴结CD4+IFN-γ+T细胞和CD4+IL-17+T细胞比例,real-time PCR检测结肠固有层细胞的CCR7 mRNA表达量及肠系膜淋巴结IL-6、IFN-γ、IL-17的mRNA表达量。6.用Western blot分别检测结肠组织中NF-κB p65、ERK1/2、STAT3的蛋白表达及其磷酸化水平。结果：1.DSS+LXA4组DAI评分和病理学分级明显低于DSS组,结肠组织中IL-6、 TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量及IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ及iNOS mRNA表达水平均低于DSS组;DSS组结肠LXA4含量和5-LOX mRNA表达量均比Control组减少。2.脾脏纯化的CD19+B细胞表达ALX/FPR2。3.在DSS诱导的急性肠炎第3、5、7天DSS组和DSS+LXA4组脾脏B10细胞比例均明显低于Control组,DSS+LXA4组与DSS组无明显差异。4.脾脏切除术后,LXA4依然能缓解肠道的急性炎症。DSS+LXA4组DAI评分明显低于DSS组,DSS+LXA4组结肠组织中IL-6、TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA的表达量明显低于DSS组。5. DSS+LXA4组腹腔巨噬细胞的吞噬能力低于DSS组,但是巨噬细胞的比例两组间没有明显差异。6.LXA4抑制DSS诱导的急性肠炎中结肠固有层和肠系膜淋巴结的CX3CR1+细胞。外周血中Ly6C+细胞的比例DSS+LXA4组和DSS组无明显差异,结肠固有层中表达CD68+的细胞DSS+LXA4组明显少于DSS组,结肠固有层及肠系膜淋巴结中DSS+LXA4组CX3CR1+细胞比例明显低于DSS组,肠系膜淋巴结IFN-γ+CD4+T细胞、IL-17+CD4+T细胞的比例DSS+LXA4组明显低于DSS组；DSS+LXA4组结肠固有层细胞CCR7 mRNA表达量低于DSS组,肠系膜淋巴结IL-6、IFN-γ、IL-17的mRNA表达量DSS+LXA4组均明显低于DSS组。7.结肠组织中NF-κB、ERK1/2和STAT3蛋白表达DSS+LXA4组与LXA4组没有显著性差异,但其磷酸化水平DSS+LXA4组明显低于LXA4组。结论：1.LXA4缓解DSS诱导的急性肠炎,但是并不依赖于脾脏B细胞的调控。2.LXA4通过减少肠道固有层CX3CR1+细胞和抑制其向淋巴结的迁移而降低T细胞免疫应答,从而发挥保护作用。3.LXA4通过抑制结肠组织的NF-κB、ERK1/2及STAT3蛋白磷酸化水平而发挥作用。第三部分 脂氧素A4在LPS诱导的脓毒血症小鼠模型中对B细胞的调控机制研究目的：脓毒血症是一种严重威胁生命的疾病,以重度炎症、多器官功能衰竭和死亡为特征。近期报道一群分泌粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的B细胞,能够在脓毒血症中起重要保护作用。脂氧素A4 (LXA4)是花生四烯酸的代谢产物,具有抗炎及促解决的特性。近年来已经报道了LXs对多种免疫细胞具有调控作用,最近有报道LXA4能够抑制人记忆B细胞的抗体产生和增生。但是关于LXA4对分泌GM-CSF的B细胞亚群的调控作用目前还没有报道。本研究通过建立LPS诱导的脓毒血症小鼠模型,探讨LXA4对分泌GM-CSF的B细胞的调控作用,为LXA4的免疫调控作用打开新的视野。方法：1.采用腹腔注射LPS (10μg/只)连续四天建立LPS诱导的脓毒血症模型,同时每天给予腹腔注射LXA4 (10μg/kg)治疗,第五天用ELISA法检测小鼠血清及腹腔灌洗液中IL-6、TNF-α和IL-1β的含量。2. real-time PCR检测小鼠脾脏和纯化的CD19+B细胞GM-CSF mRNA的表达量,流式细胞术检测脾脏中GM-CSF+CD19+B细胞的比例及平均荧光强度(MFI)= 3. real-time PCR检测脾脏纯化CD19+B细胞的VLA-4和LFA-1的mRNA水平：流式细胞术检测腹腔CD19+B的比例：将正常小鼠腹腔纯化的CD19+B细胞用CFSE标记,然后腹腔注射到小鼠体内,紧接着每天腹腔注射LPS (10μg/只)连续两天,同时每天给予LXA4 (10μg/ml)治疗,48小时后流式细胞术检测脾脏CFSE标记CD19+B细胞的比例。4. real-time PCR检测正常小鼠腹腔中纯化的巨噬细胞和B细胞上LXA4受体ALX/FPR2的表达量;用氯磷酸盐脂质体清除腹腔巨噬细胞后腹腔注射LPS(10μg/只)连续四天,同时每天给予LXA4 (10μg/kg)治疗,第5天用流式细胞术检测脾脏GM-CSF+CD19+B细胞的比例。5.我们分离脾脏细胞和纯化的CD19+B细胞,用Western blot分别检测STAT5蛋白及其磷酸化水平。结果：1.LPS+LXA4组小鼠血清及腹腔灌洗液中IL-6、TNF-α和1L-1β的含量明显低于LPS组。2.LPS+LXA4组脾脏和纯化的CD19+B细胞GM-CSF mRNA的表达量明显高于LPS组：脾脏中GM-CSF+CD19+B细胞的比例LPS+LXA4组高于LPS组,平均荧光强度LPS+LXA4组和LPS组没有显著性差异。3.LPS+LXA4组脾脏纯化CD19+B细胞中VLA-4和LFA-1的mRNA表达量显著高于LPS组;CFSE标记CD19+B细胞腹腔注射到小鼠体内48小时后,LPS+LXA4组脾脏中CFSE标记CD19+B细胞的比例明显高于LPS组。4.腹腔巨噬细胞清除后LPS+LXA4组脾脏GM-CSF+CD19+B细胞的比例明显高于LPS组。5.脾脏细胞及纯化的CD19+B细胞中LPS+LXA4组STAT5蛋白磷酸化水平均明显高于LPS组。结论：在LPS诱导的脓毒血症小鼠模型中LXA4通过促进腹腔B细胞迁移到脾脏,促使脾脏中表达GM-CSF的B细胞增多,但不依赖于腹腔巨噬细胞,从而发挥保护作用,其机制可能是通过激活STAT5通路。
[Abstract]:The expression of TNF - 伪 , IL - 6 and IL - 10 in mouse spleen and abdominal aortic lymph nodes was significantly lower than that in control group . The expression of CD4 + Foxp3 + Treg cells and Foxp3 and Tetl in the spleen and abdominal aortic lymph nodes of LPS group were significantly lower than that in control group . Objective : To study the effects of anti - inflammatory and pro - inflammatory effects of LXA4 and IL - 6 , TNF - 伪 , IL - 1尾 , IFN - 纬 and iNOS mRNA in mice with acute enteritis induced by DSS . The levels of IL - 6 , TNF - 伪 , IL - 1尾 , IFN - 纬 and IL - 6 , TNF - 伪 , IL - 1尾 , IFN - 纬 and iNOS mRNA were significantly lower in DSS group than in control group . Objective : To study the effect of LXA4 on the regulation and control mechanism of B - cells in DSS + LXA4 group . Conclusion : 1 . LXA4 is a metabolic product of arachidonic acid and has no significant difference in the levels of IL - 6 銆，

本文编号：1512245