艰难梭菌毒素TcdB转位结构域的功能及TcdB单克隆抗体的制备与应用研究

发布时间：2018-02-24 11:49

本文关键词： 艰难梭菌感染单克隆抗体转位结构域突变毒素　出处：《华南理工大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：艰难梭菌(Clostridium difficile)是一种严格厌氧、产芽孢的革兰氏阳性菌,目前被认为是引起抗生素相关腹泻及假膜性结肠炎的主要致病菌。近十几年来,由于抗生素的普及及滥用,以及高毒菌株027/NAP1/BI的出现,使艰难梭菌感染(Clostridium difficile infections,CDIs)的发生率及死亡率呈持续上升趋势,同时也对现有的治疗方法表现出了抗药性。因此,对于CDIs的预防、控制、诊断、治疗及对其致病机理的研究已经引起了全世界的广泛关注。C.difficile的致病因子主要是其分泌的两种大分子蛋白毒素——毒素A(TcdA)及毒素B(TcdB),其中TcdB被认为是CDIs感染中必需的因子。鉴于毒素在CDIs中的重要作用,目前对CDIs的致病机理研究主要集中在对毒素蛋白的结构与功能及其分子作用两方面的研究。而对于CDIs的诊断则主要通过检测病人粪便中的毒素蛋白或基因来作出诊断。因此,本论文的工作主要包括两部分:第一部分,探讨TcdB转位结构域的结构和功能;第二部分,制备能用于CDIs诊断的抗TcdB单克隆抗体并应用于实验室诊断。TcdA及TcdB由四个结构域组成,分别是葡萄糖基转移酶结构域、半胱氨酸蛋白酶结构域、转位结构域及受体结合结构域,其中转位结构域占毒素蛋白全长的45%,但是目前人们对其的结构与功能却仍不太了解。有研究表明,在转位结构域的C-端有一段由97个氨基酸组成的区域D97对TcdB的转位起关键作用,因此,本课题通过GOR4、SIMPA96及Chou-Fasman(Prot Scal)3种蛋白二级结构分析工具,对D97的二级结构进行了预测,发现位于D97 N-端的AA1756-1780区域可能对毒素的传递有重要作用。通过分子克隆手段,成功构建了毒素突变体TcdB_(Δ1756-1780)(删除AA1756-1780区域),并在巨大芽孢杆菌表达系统中对其进行了表达并纯化。对TcdB_(Δ1756-1780_的体内外毒性进行检测,发现其体内外毒性比TcdB_(fl)下降了约1×10~6倍,所以AA1756-1780对TcdB的毒性有重要作用。进一步对AA1756-1780区域的功能进行探讨。用圆二色谱分析对比了全长毒素TcdB_(fl)与TcdB_(Δ1756-1780)的整体结构,并系统地检测了TcdB_(Δ1756-1780)各个结构域的功能,发现删除AA1756-1780后,毒素的整体蛋白结构并没有明显的改变,且保留了完整的葡萄糖基转移酶、半胱氨酸蛋白酶活性及受体结合功能,同时也能在体外成功完成酸性环境下蛋白构象的改变及膜穿孔作用。然而,当以CT26全细胞为底物时,TcdB_(Δ1756-1780)却不能催化其细胞质内的Rho GTP酶进行葡萄糖基化。因此,我们对经过毒素处理的CT26细胞的内涵体进行提取并通过Western blot进行分析,发现TcdB_(Δ1756-1780)进入内涵体后,并不能顺利完成酶催化区的传递与释放,而是被困于内涵体内并迅速降解。因此,我们推断TcdB_(Δ1756-1780)并不能正确地完成酸性条件下的构象改变,导致毒素的传递及酶催化区域的释放过程受阻,从而被困于内涵体中并降解。由于CDIs所引起的腹泻等症状与其他病因引起的症状并没有明显的区别,因此实验室诊断在CDIs的诊断中起着关键性的作用。现在有多种实验室诊断方法,毒素的酶联免疫法(Toxin EIA)是其中最常用的方法,这种方法具有成本低、操作简单及检测时间短等优点,但是其灵敏度不高,因而需要提高Toxin EIA中使用的抗体的灵敏度及特异性。本论文通过使用本课题组构建的无毒的毒素突变体a TcdB作为抗原,免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,筛选得到效价较高的4株阳性杂交瘤细胞株,分别为A7、B9、D3及G2。对4株抗体进行大量制备及纯化后,分别使用间接ELISA及SPR的方法对其效价及亲和力进行了测定,A7、B9、D3及G2的效价分别为1×10~6、1×10~6、1×10~6及1×10~7,亲和力常数分别为4.29×10~(-9)、1.01×10~(-7)、1.22×10~(-8)和1.84×10~(-11)。将得到的4株抗体进行HRP标记后,在双抗夹心ELISA平台上进行抗体配对,按照抗体对所能识别抗原最低浓度对抗体配对的强弱进行评价,得到3对抗体对G2-A7、G2-B9及G2-D3。根据抗体在ELISA平台的配对结果,对抗体进行胶体金标记,初步建立针对TcdB的G2-A7胶体金快速检测平台,并使用90个临床粪便样品(40个阳性样品,50个阴性样品)对胶体金快速检测平台进行了初步的评价,其特异性及灵敏度分别为90%(95%CI:78.2%-96.7%)及92.5%(95%CI:79.6%-98.4%)。
[Abstract]:This paper studies the structure and function of TcdA and TcdB , and it has been used in laboratory diagnosis . The research shows that the pathogenesis of C . difficile is mainly focused on the structure and function of toxin protein and its molecular mechanism . In this paper , we concluded that TcdB _ ( 螖1756 - 1780 ) could not be used to carry out the transformation of protein conformation and membrane perforation in the acidic environment . The results showed that TcdB _ ( 螖1756 - 1780 ) could not be used to carry out the process of enzyme catalysis .

【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

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